腺病毒介導(dǎo)外源基因經(jīng)動脈灌注轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂腹壁淺動脈皮瓣的研究.pdf

1、軸型復(fù)合組織瓣是整形外科醫(yī)生的常用工具，在難愈性創(chuàng)面及體表腫瘤切除后的修復(fù)重建過程中發(fā)揮重要作用。通過對復(fù)合組織瓣進行基因修飾等手段從而達到基因治療的目的，是目前整形外科的研究熱點之一。有穩(wěn)定血管供應(yīng)的軸型復(fù)合組織瓣是良好靶組織，其微血管床是基因經(jīng)動脈灌注轉(zhuǎn)染的理想模型。動脈內(nèi)灌注目的基因高效轉(zhuǎn)染修飾局部組織，使其表達治療蛋白，在移植醫(yī)學(xué)及介入醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有報道，但在整形外科領(lǐng)域研究剛剛起步，相關(guān)文獻報道較少。本課題在研究改良大鼠帶蒂腹壁

2、淺動脈皮瓣(Superficial inferior epigastric artery flap，SIEAflap)模型的基礎(chǔ)上，深入探討腺病毒載體介導(dǎo)外源基因(Ad5—EGFP)經(jīng)動脈介入灌注轉(zhuǎn)染復(fù)合組織瓣的可行性、安全性并對其轉(zhuǎn)染條件作出評價。本課題由以下四個部分組成： 1、大鼠帶蒂SIEA皮瓣經(jīng)動脈灌注模型的制備。 采用乳膠血管鑄型和墨汁灌注方法對大鼠SIEA皮瓣血供系統(tǒng)進行研究。并在此基礎(chǔ)上設(shè)計手術(shù)操作步驟，形

3、成大鼠帶蒂SIEA皮瓣的暫時與體循環(huán)分離的封閉回路，經(jīng)SIEA灌注PBS觀察對實驗大鼠及皮瓣存活的影響。結(jié)果顯示，應(yīng)用微血管夾分步夾閉股動脈、肌支及腘動脈，在隱動、靜脈插管與注射泵相連，可形成由腹壁淺動、靜脈和帶蒂SIEA皮瓣微血管網(wǎng)共同構(gòu)成的灌注封閉回路。設(shè)計微血管夾的夾閉步驟，使皮瓣缺血時間控制在5～10min以內(nèi)，即對隱動、靜脈的插管固定時間。經(jīng)此操作灌注PBS術(shù)后SIEA皮瓣愈合正常，光鏡下檢測中性粒細胞計數(shù)與對照組相比無顯著差

4、異(P>0.05)。 2、Ad5—EGFP擴增純化及對大鼠微血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染效率的影響。 應(yīng)用293細胞體外擴增、純化得到滴度為9×109PFU/mlAd5—EGFP，應(yīng)用于后續(xù)細胞及動物實驗。以MOI=25、50、100、200、400、800轉(zhuǎn)染MVECs，轉(zhuǎn)染后1、3、7、14、21d應(yīng)用熒光顯微鏡、流式細胞儀觀察檢測表達EGFP細胞陽性率。MTT法檢測轉(zhuǎn)染對MVECs增殖的影響，觀察安全MOI值范圍，并在此MOI

5、值條件下調(diào)整Ad5—EGFP轉(zhuǎn)染MVECs的時間(30min、60min、90min、120min)，應(yīng)用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，Ad5—EGFP轉(zhuǎn)染MVECs后7d可見EGFP高表達，可延續(xù)到14d。在MOI≦400，Ad5—EGFP對MVECs轉(zhuǎn)染效率與MOI值呈正相關(guān)，且對轉(zhuǎn)染MVECs增殖無明顯影響，在此條件下Ad5—EGFP轉(zhuǎn)染MVECs60min即可達到78.5±1.9％轉(zhuǎn)染效率。 3、腺病毒介導(dǎo)EGFP經(jīng)

6、動脈灌注轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂SIEA皮瓣的研究。 實驗大鼠依據(jù)不同灌注液：Ad5—EGFP(3.0×106、3.0×107、3.0×108、3.0×109PFU/ml)、PBS、腺病毒空載體(Ad5—Null)，隨機分為6組。通過微血管夾暫時夾閉股動脈、肌支及胭動脈，在隱動、靜脈插管與注射泵相連，形成大鼠帶蒂SIEA皮瓣局部封閉回路，經(jīng)動脈灌注轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂SIEA60min。術(shù)后7天應(yīng)用活體成像系統(tǒng)觀察皮瓣的EGFP熒光強度，應(yīng)用共聚焦

7、顯微鏡、RT-PCR檢測皮瓣組織中EGFP的表達和分布情況，通過組織學(xué)分析對皮瓣的安全性影響。結(jié)果顯示術(shù)后7天3.0×107—9PFU/ml組活體觀察皮瓣可見體表綠色熒光信號。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果與活體觀察結(jié)果一致，其中3.0×109PFU/mlEGFP在皮瓣內(nèi)血管內(nèi)、外膜均可見表達，血管周圍組織包括脂肪、毛囊可見EGFP表達。PBS組、Ad5—Null組未見EGFP表達。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測顯示EGFPmRNA與A

8、d5—EGFP滴度值3.0×107—9PFU/ml呈劑量依賴關(guān)系。對皮瓣組織學(xué)觀察未見明顯特異性炎癥反應(yīng)。 4、不同轉(zhuǎn)染方式對大鼠SIEA皮瓣外源基因轉(zhuǎn)染及表達差異的研究。 分別經(jīng)尾靜脈注射，經(jīng)動脈灌注和皮瓣局部注射0.5ml3.0×109PFU/mlAd5—EGFP，術(shù)后1、3、7、14、21d活體成像系統(tǒng)檢測SIEA皮瓣EGFP表達的分布。另取三組同樣方法處理的大鼠，于術(shù)后7d取材用于從組織形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)兩方面評

9、價不同轉(zhuǎn)染方法對皮瓣局部EGFP表達的影響及不同轉(zhuǎn)染方法對全身重要臟器的影響。結(jié)果顯示，Ad5—EGFP在3.0×109PFU/ml滴度條件下，經(jīng)動脈灌注可以有效轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂SIEA皮瓣，且對于大鼠重要臟器無明顯影響。經(jīng)尾靜脈注射不能夠有效轉(zhuǎn)染皮瓣，且在大鼠肝臟中可見EGFP表達。皮瓣局部注射可以有效轉(zhuǎn)染大鼠SIEA皮瓣，但與經(jīng)動脈灌注轉(zhuǎn)染相比，目的蛋白表達分布欠均勻。活體成像系統(tǒng)可以直觀檢測大鼠帶蒂SIEA皮瓣EGFP表達的強度及陽性

10、表達區(qū)域的分布。 綜上所述，本實驗建立了操作簡便、穩(wěn)定的大鼠帶蒂SIEA皮瓣經(jīng)動脈灌注研究模型。腺病毒載體可以將外源基因EGFP經(jīng)動脈灌注轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂SIEA皮瓣的微血管床，使大鼠帶蒂SIEA皮瓣作為目的基因表達載體并最終產(chǎn)生目的蛋白。與局部注射和全身轉(zhuǎn)染的方法相比，經(jīng)動脈灌注基因修飾復(fù)合組織瓣的方法局部靶向性更強并且對全身無明顯毒副作用。實驗中采用活體成像技術(shù)直接觀察術(shù)后皮瓣EGFP表達情況，使目的蛋白的檢測更加直觀，為進一步