經(jīng)動(dòng)脈灌注慢病毒介導(dǎo)的CD-TK基因轉(zhuǎn)染大鼠腹壁游離皮瓣治療乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　1、檢測(cè)慢病毒載體介導(dǎo)的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶/單純皰疹病毒胸苷激酶(CD/TK)雙自殺基因在大鼠乳腺癌SHZ-88細(xì)胞中的表達(dá)情況和對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)與旁觀者效應(yīng)。
　　2、評(píng)估經(jīng)動(dòng)脈灌注重組慢病毒轉(zhuǎn)染SD大鼠游離腹壁淺動(dòng)脈穿支(SIEA)皮瓣后CD/TK基因在皮瓣內(nèi)的表達(dá)情況。
　　3、探討CD/TK雙自殺基因過(guò)表達(dá)慢病毒體系聯(lián)合前藥5-氟胞嘧啶與更昔洛韋(5-FC+GCV)對(duì)大鼠乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的抑

2、制情況。
　　4、探討游離皮瓣在感染CD/TK雙自殺基因過(guò)表達(dá)慢病毒體系后是否會(huì)產(chǎn)生全身性的毒副反應(yīng)。
　　方法:
　　1、將擴(kuò)增后的載體質(zhì)粒（目的質(zhì)?；蚩蛰d質(zhì)粒）、慢病毒包裝質(zhì)粒與包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T感受態(tài)細(xì)胞，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，將細(xì)胞上清液高速離心以濃縮純化病毒，將濃縮的慢病毒10倍梯度稀釋后感染HEK293T細(xì)胞，觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)情況，根據(jù)下列公式計(jì)算重組慢病毒的滴度:

3、病毒滴度=表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)/病毒原液量。
　　2、分別將不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的LV-CD/TK與LV-GFP重組慢病毒感染SHZ-88細(xì)胞，測(cè)定慢病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率;采用CCK-8檢測(cè)感染慢病毒后SHZ-88細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;通過(guò)RT-PCR與western blot檢測(cè)感染慢病毒體系后的SHZ-88細(xì)胞中CD/TK基因的表達(dá)情況;將不同濃度的5-FC與GCV單獨(dú)或聯(lián)合加入感染慢病毒后的SHZ-88細(xì)胞中，通過(guò)CCK-8與M

4、useTM CellAnalyzer檢測(cè)細(xì)胞的增殖、凋亡和周期的變化情況;將一定濃度的5-FC與GCV聯(lián)合加入感染慢病毒后的SHZ-88細(xì)胞中，隨后收集細(xì)胞上清，并加入到正常的SHZ-88細(xì)胞中，通過(guò)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
　　3、解剖SD大鼠的SIEA皮瓣以了解局部血管的關(guān)系與走行;經(jīng)股動(dòng)脈-腹壁淺動(dòng)脈途徑灌注甲紫溶液以觀察腹壁淺動(dòng)脈的供血范圍;將SHZ-88細(xì)胞接種于SIEA皮瓣的皮下，觀察皮瓣的成活情況以及移植瘤的生

5、長(zhǎng)情況。
　　4、切取并游離SD大鼠的SIEA皮瓣，經(jīng)股動(dòng)脈-腹壁淺動(dòng)脈途徑灌注重組慢病毒溶液或PBS，體外孵育1h后原位移植SIEA皮瓣，術(shù)后第7天通過(guò)RT-PCR與western blot檢測(cè)CD/TK基因在SIEA皮瓣、受植創(chuàng)面與各臟器（心、肝、肺、腎、脾與小腸）中的表達(dá)情況。同上將重組慢病毒溶液或PBS經(jīng)動(dòng)脈灌注SIEA皮瓣，原位移植皮瓣后，將SHZ-88細(xì)胞接種于SIEA皮瓣的皮下，術(shù)后30天內(nèi)每天經(jīng)腹腔注射前藥5-FC

6、+GCV，定期測(cè)量移植瘤體積，繪制生長(zhǎng)曲線。每周抽取SD大鼠靜脈血檢測(cè)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）與天門冬氨基酸轉(zhuǎn)移酶(AST)水平的變化情況。術(shù)后第42天切取瘤體，稱重并計(jì)算抑瘤率，將瘤體與各臟器標(biāo)本行HE染色觀察組織病理學(xué)變化。
　　結(jié)果:
　　1、CD/TK重組慢病毒的包裝與滴度測(cè)定:(1)將三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48h后，95％以上的細(xì)胞都表達(dá)綠色熒光蛋白，說(shuō)明HEK293細(xì)胞對(duì)重組慢病毒的包裝過(guò)程順利，包

7、裝效果顯著。(2)測(cè)定病毒滴度，當(dāng)病毒原液量為10-5μl時(shí)，CD/TK重組慢病毒組與空載慢病毒組中分別可見(jiàn)2個(gè)與1個(gè)帶綠色熒光的細(xì)胞，經(jīng)計(jì)算，CD/TK重組慢病毒與空載慢病毒的滴度分別為2E+8TU/ml與1E+8TU/ml。
　　2、CD/TK雙自殺基因聯(lián)合前藥對(duì)SHZ-88細(xì)胞的直接殺傷效應(yīng)與旁觀者效應(yīng):
　　(1)CD/TK重組慢病毒對(duì)SHZ-88細(xì)胞的感染情況與空載慢病毒相似，隨著慢病毒MOI的增加，GFP陽(yáng)性細(xì)胞

8、增加，熒光亮度增強(qiáng)，當(dāng)MOI=100時(shí)，95％以上的細(xì)胞表達(dá)GFP，經(jīng)CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MOI100以內(nèi)的病毒液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響;當(dāng)MOI=200時(shí)，幾乎所有細(xì)胞表達(dá)GFP，但是病毒液對(duì)細(xì)胞有毒性，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。(2)通過(guò)RT-PCR與western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感染LV-CD/TK的SHZ-88細(xì)胞中出現(xiàn)CD/TK融合基因mRNA水平與蛋白水平的表達(dá)，而感染LV-GFP或未感染病毒的SHZ-88細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)CD/TK基因的

9、表達(dá)。(3)實(shí)驗(yàn)組的SHZ-88細(xì)胞對(duì)前藥5-FC+GCV具有較高的敏感性，細(xì)胞的存活率隨前藥濃度的增高而逐漸下降，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(P＜0.001)，并且聯(lián)用前藥5-FC+GCV時(shí)，該組細(xì)胞的存活率明顯低于單用前藥GCV或5-FC時(shí)(P＜0.01);而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)未受明顯抑制。在給予前藥5-FC+GCV處理后，實(shí)驗(yàn)組SHZ-88細(xì)胞的凋亡率以及細(xì)胞周期中處于G1期的比率均明顯高于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的細(xì)胞(P＜0

10、.01)。(4)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)前藥5-FC+GCV處理后的細(xì)胞上清液可顯著抑制正常SHZ-88細(xì)胞的生長(zhǎng)(P＜0.001)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的細(xì)胞上清對(duì)正常SHZ-88細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。
　　3、SD大鼠SIEA皮瓣的血供系統(tǒng)與體內(nèi)的成瘤效果:(1)經(jīng)解剖SD大鼠SIEA皮瓣發(fā)現(xiàn)，股動(dòng)脈自腹股溝處向外走行約1.4cm后可恒定發(fā)出腹壁淺動(dòng)脈分支支配SIEA皮瓣。甲紫溶液經(jīng)股動(dòng)脈-腹壁淺動(dòng)脈途徑灌注后在SIEA皮瓣內(nèi)的分布范圍超

11、過(guò)2.5cm×2.5cm。(2)將SHZ-88細(xì)胞接種于SIEA皮瓣的皮下后，皮瓣成活良好，乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)速度平穩(wěn)。
　　4、CD/TK重組慢病毒灌注SIEA皮瓣聯(lián)合前藥對(duì)SD大鼠乳腺癌模型的療效觀察:(1)SD大鼠SIEA皮瓣經(jīng)動(dòng)脈灌注病毒液或PBS后第7天，通過(guò)RT-PCR與western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組SIEA皮瓣的蒂部、近蒂端與遠(yuǎn)蒂端均有CD/TK融合基因mRNA水平與蛋白水平的表達(dá)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的

12、皮瓣內(nèi)、實(shí)驗(yàn)組的受植創(chuàng)面上以及各臟器（心、肝、肺、腎、脾與小腸）內(nèi)均未見(jiàn)CD/TK基因的表達(dá)。(2)SD大鼠的SIEA皮瓣經(jīng)動(dòng)脈灌注病毒液或PBS，皮瓣皮下接種SHZ-88細(xì)胞，連續(xù)腹腔注射前藥5-FC+GCV30天后，各組中瘤體最終體積、最終瘤重與抑瘤率結(jié)果分別為:實(shí)驗(yàn)組:104.00±7.53mm3，122.25±6.93mg，83.02％;陰性對(duì)照組:690.10±41.95mm3，693.56±26.91mg，3.70％;空白對(duì)

13、照組:706.57±21.22mm3，720.17±23.15mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)?？梢?jiàn)，與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組的移植瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制;通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的瘤體內(nèi)可見(jiàn)明顯的變性壞死灶，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的瘤體未見(jiàn)明顯變化。(3)定期抽取SD大鼠靜脈血檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組血清中的ALT與AST水平在術(shù)后42天內(nèi)未見(jiàn)大幅度的波動(dòng)。通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的各臟器內(nèi)均無(wú)明顯的炎

14、性細(xì)胞的浸潤(rùn)，也未發(fā)現(xiàn)SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:
　　1、利用三質(zhì)粒包裝法可順利包裝CD/TK雙自殺基因過(guò)表達(dá)慢病毒體系以及空載慢病毒體系。
　　2、LV-CD/TK感染SHZ-88細(xì)胞后，CD/TK雙自殺基因可在細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá);CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合前藥5-FC+GCV可顯著殺傷SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞，有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起乳腺癌細(xì)胞周期G1期阻滯，并且在聯(lián)用前藥5-FC+GCV時(shí)對(duì)SH

15、Z-88細(xì)胞的殺傷效應(yīng)明顯優(yōu)于單用前藥GCV或5-FC時(shí)，此外，CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合前藥5-FC+GCV對(duì)SHZ-88細(xì)胞可產(chǎn)生明顯的旁觀者效應(yīng)。
　　3、SD大鼠的SIEA皮瓣具有穩(wěn)定的供血系統(tǒng)，腹壁淺動(dòng)脈供血范圍超過(guò)2.5cm×2.5cm;SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞在SD大鼠SIEA皮瓣的皮下成瘤效果穩(wěn)定，重復(fù)性好。
　　4、LV-CD/TK可經(jīng)股動(dòng)脈-腹壁淺動(dòng)脈途徑灌注大鼠SIEA皮瓣，術(shù)后7天CD/TK雙自殺