NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在模擬失重大鼠動(dòng)脈重建中的作用.pdf

1、航天飛行時(shí)，暴露于微重力環(huán)境可導(dǎo)致航天員心血管系統(tǒng)發(fā)生功能與結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性變化，當(dāng)返回地面1G重力環(huán)境或受到其他立位應(yīng)激時(shí)，普遍出現(xiàn)明顯的心血管失調(diào)反應(yīng)，主要表現(xiàn)為立位耐力不良和運(yùn)動(dòng)能力降低。近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，人們對(duì)航天后心血管失調(diào)的發(fā)生機(jī)理已取得一定認(rèn)識(shí)，雖然尚需更多深入的研究工作予以全面闡明，但已有研究結(jié)果證實(shí)，動(dòng)脈功能調(diào)整與結(jié)構(gòu)重塑可能是航天飛行后立位耐力不良發(fā)生的主要機(jī)制之一。
　　微重力環(huán)境下，由于流體靜壓消失，全身動(dòng)脈血管

2、系統(tǒng)跨壁壓及血液分布發(fā)生變化，與地面1G重力下直立體位時(shí)相比，人腦部動(dòng)脈處于相對(duì)升高的“高血壓”狀態(tài)，而下身動(dòng)脈則處于相對(duì)降低的“低血壓”狀態(tài)。近年來(lái)，地面模擬失重大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)區(qū)域特異性改變：大鼠前身動(dòng)脈血管發(fā)生肥厚性改變，血管收縮反應(yīng)性增強(qiáng)；后身動(dòng)脈發(fā)生萎縮性改變，血管收縮反應(yīng)性減弱。另外，內(nèi)皮依賴性舒張功能在模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和基底動(dòng)脈均明顯降低，提示模擬失重大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮功能可能發(fā)生變化。在闡

3、明流體靜壓改變引起動(dòng)脈功能調(diào)整與結(jié)構(gòu)重塑的機(jī)理時(shí)，我們和其他實(shí)驗(yàn)室均發(fā)現(xiàn)模擬失重大鼠局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)（local rennin-angiotension system，L-RAS）在動(dòng)脈系統(tǒng)亦呈現(xiàn)區(qū)域特異性改變：RAS主要成份，血管緊張素原和血管緊張素Ⅱ1型受體的基因和蛋白，在前身表達(dá)上調(diào)，而在后身表達(dá)下調(diào)。另外，L-RAS可能通過(guò)氧化應(yīng)激損傷機(jī)制參與模擬失重大鼠動(dòng)脈功能的適應(yīng)性變化。除此之外，血管平滑肌離子通道機(jī)制可能亦參與模

4、擬失重引起的血管適應(yīng)性變化，并可能發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。然而，L-RAS和血管平滑肌離子通道機(jī)制只能部分解釋模擬失重所致的動(dòng)脈內(nèi)皮功能異常的發(fā)生。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，模擬失重引起大鼠動(dòng)脈血管產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，無(wú)論在彈力型大動(dòng)脈（腹主動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈）還是在肌型小動(dòng)脈（腦動(dòng)脈），活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要成份超氧陰離子（superoxide anion，O2-·）水平均明顯升高。核因子-κB（nuclea

5、r factorκB，NF-κB）被認(rèn)為是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與心血管系統(tǒng)的炎性反應(yīng)、細(xì)胞增生、分化和凋亡等過(guò)程。在心血管功能和結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)機(jī)制中，NF-κB是L-RAS和ROS下游的共同通路，參與多種心血管疾病血管功能損傷的病理生理過(guò)程。在失重/模擬失重狀態(tài)下，NF-κB是否參與彈力型大動(dòng)脈及肌型小動(dòng)脈功能的損傷過(guò)程目前尚未有報(bào)道。另外，本實(shí)驗(yàn)室前期工作中僅在動(dòng)脈血管炎性反應(yīng)方面作了初步研究，對(duì)模擬失重后動(dòng)脈炎性反應(yīng)情況尚缺乏全面的了

6、解。NF-κB是否通過(guò)炎性反應(yīng)機(jī)制參與模擬失重大鼠前身和后身彈力型大動(dòng)脈及肌型小動(dòng)脈血管內(nèi)皮功能的重塑過(guò)程也有待進(jìn)一步探討。
　　為了回答上述問(wèn)題，我們采用尾部懸吊大鼠模型模擬微重力對(duì)心血管系統(tǒng)的影響，并進(jìn)行以下工作：
　　1.模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈血管NF-κB蛋白表達(dá)與活性改變
　　采用Western blot方法觀察模擬失重3天、14天和28天后大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈NF-κB亞單位p65

7、蛋白在胞核與胞漿的分布變化以及IκBα蛋白的表達(dá)變化，檢測(cè)模擬失重對(duì)NF-κB由胞漿向胞核轉(zhuǎn)位的影響并確定何時(shí)影響最為明顯。另外，使用NF-κB抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC,100 mg/kg/day）慢性灌胃干預(yù)處理，觀察模擬失重后NF-κB DNA結(jié)合能力的變化，并觀察PDTC對(duì)模擬失重大鼠動(dòng)脈NF-κB DNA結(jié)合能力的抑制作用。
　　2.模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸

8、總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈血管炎性反應(yīng)及NF-κB的調(diào)控作用
　　通過(guò)en face免疫熒光染色和離體血管內(nèi)皮單核細(xì)胞粘附能力檢測(cè)，觀察模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈的單核細(xì)胞浸潤(rùn)情況以及動(dòng)脈內(nèi)皮的單核細(xì)胞粘附能力；通過(guò)Western blot和免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈炎性反應(yīng)相關(guān)因子血管細(xì)胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule1，VCAM-1）、E-選擇素（E-se

9、lectin）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein1，MCP-1）的表達(dá)變化；通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)模擬失重大鼠血漿中白介素6（interleukin6，IL-6）含量的變化。另外，采用PDTC慢性干預(yù)處理，通過(guò)實(shí)時(shí)定量 PCR方法檢測(cè) NF-κB激活對(duì)模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈VCAM-1、E-selectin和MCP-1 mRNA水平的影響。
　　3. NF-κB通

10、路抑制劑PDTC對(duì)模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈舒張反應(yīng)性的影響
　　采用PDTC慢性干預(yù)處理，通過(guò)動(dòng)脈反應(yīng)性測(cè)定，觀察PDTC對(duì)模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈血管舒張反應(yīng)性變化的影響。
　　本工作的主要結(jié)果如下：
　　1.模擬失重增強(qiáng)了大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈血管NF-κB的活性
　　Western blot結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈NF-κB亞

11、單位p65蛋白在胞核中表達(dá)隨懸吊時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，胞漿p65和IκBα蛋白的表達(dá)則隨著懸吊時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，其中腹主動(dòng)脈變化早于頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈。凝膠電泳遷移率分析結(jié)果顯示：28天模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈NF-κB的DNA結(jié)合能力與對(duì)照組相比均明顯增強(qiáng)；PDTC慢性干預(yù)處理明顯降低了腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈增強(qiáng)的NF-κB DNA結(jié)合能力，但在腦動(dòng)脈僅有部分恢復(fù)。
　　2.模擬失重增強(qiáng)了大鼠腹主動(dòng)脈和頸總動(dòng)

12、脈的單核細(xì)胞浸潤(rùn)及與THP-1細(xì)胞的粘附，NF-κB參與模擬失重引起的大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈及腦動(dòng)脈血管炎性反應(yīng)的發(fā)生
　　En face免疫熒光染色結(jié)果顯示，模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈單核細(xì)胞浸潤(rùn)增加。離體血管內(nèi)皮單核細(xì)胞粘附能力測(cè)定結(jié)果顯示，模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈內(nèi)皮表面粘附的THP-1細(xì)胞明顯增多。Western blot和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈血管E-selectin和

13、MCP-1蛋白表達(dá)上調(diào)；VCAM-1在模擬失重大鼠頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈表達(dá)上調(diào)，但在腹主動(dòng)脈表達(dá)沒(méi)有改變；模擬失重大鼠各動(dòng)脈增加的炎性因子陽(yáng)性表達(dá)主要集中于內(nèi)皮層和平滑肌內(nèi)層。酶聯(lián)免疫吸附結(jié)果顯示，模擬失重大鼠血漿中IL-6水平與對(duì)照組大鼠相比明顯升高。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和腦動(dòng)脈VCAM-1、E-selectin和MCP-1的mRNA水平與對(duì)照組相比均明顯增高；PDTC慢性干預(yù)處理明顯降低模擬失重大鼠腹主

14、動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈炎性因子的mRNA水平，在腦動(dòng)脈僅降低了MCP-1的水平。
　　3. NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)參與模擬失重所致大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的降低
　　離體動(dòng)脈血管環(huán)實(shí)驗(yàn)表明：模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈ACh介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)性與對(duì)照組大鼠相比明顯降低；PDTC慢性干預(yù)處理可明顯改善模擬失重大鼠腹主動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈降低的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)性，但在大腦中動(dòng)脈僅有恢復(fù)趨勢(shì)。