NF-κB信號(hào)通路參與介導(dǎo)的自噬在高血壓大鼠心血管重構(gòu)的作用研究.pdf

1、背景：
　　心肌肥厚多是由高血壓病造成的，也常見于瓣膜性心臟病，例如主動(dòng)脈瓣狹窄。早期發(fā)生的改變是心臟發(fā)生代償反應(yīng)，用以增加心排血量;但到后期，則可能成為不可逆轉(zhuǎn);左心室肥厚最終會(huì)導(dǎo)致臨床癥狀的惡化，包括終末期心衰。我們已知，自噬是一個(gè)高度保守的細(xì)胞過程，負(fù)責(zé)清除或回收壽命長的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，它還可提供給其它細(xì)胞二次利用的營養(yǎng)，包括細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。這種行為可以為細(xì)胞提供能量。然而，在某些情況下，自噬可能是有害的，因?yàn)樽允傻耐?/p>

2、噬作用產(chǎn)生細(xì)胞損害。當(dāng)前對(duì)于自噬在心肌肥厚中的作用有許多研究，但是其作用究竟是有益還是有害目前還不清楚，其中具體的機(jī)制亦不清楚。
　　目的：
　　1.探討應(yīng)用核磁影像技術(shù)觀察自發(fā)性高血壓大鼠的左室變化，心功能變化;
　　2.探討自噬及氧化應(yīng)激在自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚時(shí)期的心肌組織中的活性表達(dá);探討自發(fā)性高血壓大鼠時(shí)期的心肌組織的自噬活性表達(dá)與左室肥厚、心肌纖維化以及氧化應(yīng)激的相關(guān)性。初步研究自噬與線粒體變化的關(guān)系。<

3、br>　　3.探討自噬在自發(fā)性高血壓大鼠活性表達(dá)的趨勢(shì)原因及可能的信號(hào)通路以及與NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)性。探討NF-κB p65信號(hào)通路在心肌肥厚中自噬中的作用及分子機(jī)制
　　方法：
　　對(duì)4月大的SHR和WKY大鼠各14只進(jìn)行喂養(yǎng)，其中7只SHR和7只WKY應(yīng)用吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)治療，時(shí)間為16周。其余7只SHR和7只WKY繼續(xù)普通喂養(yǎng)。老鼠被分為4組:1)WKY大鼠(WKY)2)SHR(SHR)和3）S

4、HR應(yīng)用PDTC(SHR+PDTC)，4)WKY應(yīng)用PDTC(wKY+PDTC)。PDTC飲用的劑量105毫克/公斤/天。
　　在給予PDTC進(jìn)行了16周結(jié)束時(shí)，動(dòng)物被用于血壓測(cè)量和試驗(yàn)研究。所有實(shí)驗(yàn)都是在遵守山東大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指導(dǎo)方針和協(xié)議。
　　進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):(1)各組大鼠測(cè)量體重，測(cè)量尾動(dòng)脈血壓。做血液生化檢查。(2)處死前開始前進(jìn)行核磁共振檢查，測(cè)定舒張末期左室內(nèi)徑(LVEDd)、舒張末期室間隔的厚度(IVSd)

5、、舒張末期左室后壁的厚度(LVPWd)、左室收縮末期面積(LVSA)、左室舒張末期面積(LVDA)、左室質(zhì)量（Lvmass）、收縮末期容積(ESV)、舒張末期容積(EDV)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。(3)做心肌組織超微結(jié)構(gòu)和病理學(xué)檢查，HE檢查。(4)檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA。(5)電鏡檢查檢測(cè)自噬的表達(dá)及與心肌肥厚各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性。(6)心肌MASSON檢查分析心肌膠原比及與自噬的相關(guān)性。(7)免疫組化檢查檢測(cè)各組大鼠自噬的表達(dá)及與心肌

6、肥厚各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性。(8)半定量PCR檢查檢測(cè)自噬的表達(dá)及與心肌肥厚指標(biāo)相關(guān)性。(9) Westen blot法檢測(cè)自噬的表達(dá)及與心肌肥厚各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性。Western blot法檢測(cè)自噬信號(hào)表達(dá)的通路。Westen blot法檢測(cè)NF-κ B信號(hào)通路的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況:
　　實(shí)驗(yàn)過程中共有3只大鼠死亡，WKY大鼠組一只，SHR大鼠組二只。在普通喂養(yǎng)內(nèi)死亡。其他組無死亡。共25只大鼠完成實(shí)

7、驗(yàn)。
　　2.各組大鼠基本指標(biāo)比較
　　喂養(yǎng)前，與WKY對(duì)照組比較， SHR大鼠組尾動(dòng)脈收縮壓升高，差異有意義(P＜0.05);喂養(yǎng)后，WKY組較前血壓上升，但是SHR組尾動(dòng)脈收縮壓較WKY對(duì)照組明顯升高，有顯著性差異(P＜0.01)，（P＞0.05）。SHR+PDTC組相比未經(jīng)處理的SHR組血壓低30毫米汞柱。表明SHR+PDTC組呈顯著降低舒張壓和收縮壓。WKY組與WKY+PDTC組組間比較無明顯變化。
　　3.核

8、磁共振檢查
　　由專人采用荷蘭philipe3.0T核磁共振儀，測(cè)取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的舒張末期室間隔的厚度(IVSd)、舒張末期左室后壁的厚度(LVPWd)、左室收縮末期面積(LVSA)、舒張末期左室內(nèi)徑(LVEDd)左室舒張末期面積(LVDA)、左室質(zhì)量(Lvmass)、收縮末期容積(ESV)、舒張末期容積(EDV)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)取其均值。
　　LVEF各組沒有顯著性差異。SHR組IVSd、PWT、LVM、LV

9、MI均較WKY明顯升高，有顯著性差異(P＜0.01)，與SHR+PDTC組比較示以上結(jié)果有增高。WKY組與WKY+PDTC組IVSd、PWT、LVM、LVMI值兩組間比較無明顯差異，與SHR組、SHR+PDTC組比較有明顯差異(P＜0.05)。
　　4.心肌組織病理觀察
　　HE染色顯示:WKY組、WKY+PDTC組心肌細(xì)胞體積較小，形態(tài)較均勻，排列較整齊;SHR組心肌細(xì)胞較其他組體積變大，形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則，排列紊亂;細(xì)胞壁不

10、完全清楚，細(xì)胞連接處可見融合現(xiàn)象。SHR+PDTC組與SHR組比較示細(xì)胞體積無區(qū)別，但是細(xì)胞形態(tài)較后者規(guī)則，排列無紊亂。SHR+PDTC組與WKY組、WKY+PDTC組比較細(xì)胞體積較大。
　　5.心肌纖維化定性及定量分析
　　Masson染色膠原含量的檢測(cè):WKY組心肌纖維排列整齊，心肌內(nèi)冠狀動(dòng)脈周圍有少量膠原沉積，心肌間質(zhì)內(nèi)膠原多呈長條狀分布;SHR組與WKY組比較，心肌細(xì)胞腫大，肌纖維排列紊亂，心肌冠狀動(dòng)脈周圍及心肌間質(zhì)

11、膠原顯著增多，而且呈現(xiàn)交聯(lián)狀。WKY組心肌細(xì)胞腫大的現(xiàn)象明顯減少。SHR+PDTC組與SHR組比較，前者血管周圍及心肌間質(zhì)膠原有所減少。
　　定量分析測(cè)量心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)和心肌內(nèi)血管周圍膠原面積(PVCA)。與WKY組相比，SHR組左室心肌組織膠原含量明顯升高(P＜0.01）。WKY組與WKY+PDTC組比較，左室心肌組織膠原含量無明顯區(qū)別。SHR+PDTC組與SHR組比較，前者心肌膠原含量有減少。
　　6.氧化應(yīng)

12、激指標(biāo)檢測(cè)
　　SHR組明顯高于WKY組、WKY+PDTC組、SHR+PDTC組。WKY組與WKY+PDTC組比較無明顯區(qū)別。SHR+PDTC組高于WKY組、WKY+PDTC組。
　　7.免疫組化檢查檢測(cè)自噬的表達(dá)及與心肌肥厚各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性。
　　與WKY對(duì)照組相比，SHR組大鼠心肌組織中自噬表達(dá)明顯升高(P＜0.01);SHR組自噬表達(dá)水平也高于SHR+PDTC組、WKY+PDTC組(P＜0.01)。WKY組與WKY

13、+PDTC組大鼠比較沒有顯著性變化。
　　SHR組自噬表達(dá)與IVST、LVM、LVMI呈明顯的正相關(guān)（r=0.74，P＜0.01）。
　　8.半定量PCR檢查檢測(cè)自噬的表達(dá)及與心肌肥厚各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性。
　　與WKY對(duì)照組相比，SHR組大鼠心肌組織中自噬表達(dá)明顯升高(P＜0.01);SHR組自噬表達(dá)水平也高于SHR+PDTC組、WKY+PDTC組(P＜0.01)。WKY組與WKY+PDTC組大鼠比較沒有顯著性變化。

14、>　　9.電鏡檢查檢測(cè)自噬的表達(dá)及與心肌肥厚各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性。
　　與WKY和SHR+PDTC對(duì)照組相比，SHR組大鼠的電鏡切片觀察結(jié)果示自噬泡明顯增多趨勢(shì)，WKY組與WKY+PDTC組比較，電鏡切片自噬泡無明顯變化。
　　10.Westen blot檢測(cè)各組心肌組織中自噬的表達(dá)
　　與WKY對(duì)照組相比，SHR組大鼠心肌組織中LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ表達(dá)明顯升高(P＜0.01);與WKY對(duì)照組相比，WKY+PDTC組大鼠的

15、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ沒有顯著性變化。
　　SHR組LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ表達(dá)與IVST、LVM、LVMI呈明顯的正相關(guān)(r=0.74，P＜0.01）。
　　Western blot測(cè)定AKT、AMPK、S6K、mTOR的表達(dá);與WKY對(duì)照組相比，SHR組大鼠心肌組織中表達(dá)明顯升高(P＜0.01); SHR組表達(dá)水平也高于SHR+P組、WKY+P組(P＜0.01)。WKY組與WKY+P組大鼠比較沒有顯著性變化。
　　W

16、estern blot測(cè)定NF-κ Bp65的表達(dá):與WKY對(duì)照組相比，SHR組大鼠心肌組織中NF-κ Bp65的表達(dá)明顯增高。(P＜0.01);SHR組表達(dá)水平也高于SHR+PDTC組、WKY+PDTC組(P＜0.01)。WKY組與WKY+PDTC組大鼠比較沒有顯著性變化。
　　結(jié)論：
　　1.核磁共振結(jié)果顯示SHR大鼠心肌肥厚形成，心臟腔徑發(fā)生變化，心肌明顯纖維化。作為研究心肌肥厚動(dòng)物模型，我們采用核磁共振檢查方法為心肌

17、肥厚左室重構(gòu)的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2.自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織中自噬表達(dá)升高，且與心肌肥厚相關(guān)指標(biāo)呈明顯正相關(guān)，提示自噬參與了自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚的病變過程。其中，氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)示MDA在SHR組明顯增高。
　　3.自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織纖維化與自噬有相關(guān)性。各種檢測(cè)方法的綜合應(yīng)用，其中電鏡檢查可作為明顯可靠的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)線粒體的測(cè)量數(shù)據(jù)表明自噬與線粒體的變化密切相關(guān)。
　　4.NF-κ Bp65信號(hào)通路有在心肌