FEZ1在星形膠質(zhì)細胞中的表達及其功能研究.pdf

1、星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、分布最廣，在形態(tài)、受體的分布及胞質(zhì)活性物質(zhì)的含量等方面都存在明顯的異質(zhì)性，不同譜系發(fā)生的星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所起的作用至今仍不明確。 目的： (1)分離、培養(yǎng)獲得不同譜系來源的兩型星形膠質(zhì)細胞(T1A和T2A)，通過基因表達譜芯片技術(shù)構(gòu)建星形膠質(zhì)細胞基因表達譜，進行對比分析，篩選出細胞特異性差異表達基因。 (2)從獲得的基因表達譜中，選定在膠質(zhì)細胞中新發(fā)現(xiàn)的軸突成束和

2、延伸相關(guān)基因FEZ1，分析FEZ1在培養(yǎng)的兩型星形膠質(zhì)細胞中的表達定位。 (3)分析FEZ1在大鼠腦組織發(fā)育過程中的表達變化。 (4)通過FEZ1基因克隆，瞬時轉(zhuǎn)染及原核表達方法，初步探討FEZ1對星形膠質(zhì)細胞活性及神經(jīng)元突起生長的影響。 方法： 第一部分(1)采用振蕩法和差速貼壁法，從新生一天SD大鼠大腦皮層分離獲得T1A和T2A，免疫熒光雙標鑒定；(2)應用BiostarR-40s基因表達譜芯片技術(shù)對

3、比分析在培養(yǎng)的T1A和T2A中細胞特異性差異表達基因情況。 第二部分(1)利用半定量RT-PCR、Realtime RT-PCR、western blot和細胞免疫化學的方法檢測FEZ1基因在T1A和T2A中的表達及細胞定位情況，驗證基因表達譜芯片結(jié)果。(2)取生后1天、3天、7天、2周、1個月、3個月的SD大鼠，灌注后取腦進行冰凍切片，并分別以FEZ1和GFAP或NF對星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元進行免疫熒光雙標，檢測FEZ1在腦組織

4、發(fā)育過程中的表達定位。 第三部分應用RT-PCR方法從大鼠大腦皮層克隆獲得FEZ1全長序列，構(gòu)建pEGFP-N1-FEZ1真核表達重組質(zhì)粒和FEZ1 RNAi質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞，MTT法檢測細胞活力，初步觀察FEZ1基因?qū)π切文z質(zhì)細胞生長的影響；構(gòu)建pET-28a-FEZ1原核表達重組質(zhì)粒，體外原核表達His-FEZ1融和蛋白，觀察FEZ1對背根節(jié)神經(jīng)元突起生長的影響。 結(jié)果： (1)應用上海博星基因芯片

5、公司星形膠質(zhì)細胞基因表達譜芯片BiostarR-40s，四次芯片結(jié)果交集顯示，在4096個檢測點中，發(fā)現(xiàn)差異表達基因138條，99個為已知基因，其中42個在T1A中高表達，57個在T2A中高表達。與神經(jīng)軸突傳導相關(guān)基因均在T2A中表達上調(diào)，其中新發(fā)現(xiàn)的與軸突成束和延伸相關(guān)的FEZ1基因在膠質(zhì)細胞中的表達及作用國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報道。 (2)RT-PCR及western blot結(jié)果顯示FEZ1在體外培養(yǎng)的兩型星形膠質(zhì)細胞中mR

6、NA水平及蛋白水平均有表達，且在T2A中表達明顯增加，與基因表達譜芯片結(jié)果一致。細胞免疫熒光雙標結(jié)果顯示，F(xiàn)EZ1蛋白在O2A祖細胞、T1A、T2A細胞中均有表達，分布于細胞胞漿及突起，在T1A及T2A中可與GFAP共定位，細胞核中沒有表達。 (3)FEZ1在大鼠腦組織嗅球的僧帽細胞和顆粒細胞，海馬齒狀回的顆粒細胞，海馬CA1-3區(qū)的錐體細胞，皮層錐體細胞也有表達，嗅球及海馬齒狀回星形膠質(zhì)細胞有表達，生后7天FEZ1表達量達最高

7、。 (4)構(gòu)建的pEGFP-N1-FEZ1真核重組質(zhì)粒和FEZ1 RNAi質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定正確，瞬時轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞，干擾FEZ1基因表達可降低細胞活力，抑制細胞生長。 (5)構(gòu)建的pET-28a-FEZ1原核表達重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定正確，在BL21大腸桿菌中經(jīng)誘導可表達His-FEZ1融和蛋白，該蛋白對大鼠背根節(jié)突起生長有一定促進作用。 結(jié)論： (1)不同譜系來源的兩型星形膠質(zhì)細胞基因表達譜存在明顯差異，其

8、中與神經(jīng)軸突傳導相關(guān)基因表達差異提示T1A和T2A可能在誘導軸突生長方面有不同功能。 (2)首次研究證實，F(xiàn)EZ1基因在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)譜系細胞中均有表達，但在T2A中表達明顯增加。 (3)FEZ1在大鼠腦組織發(fā)育過程中嗅球、海馬神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞中有表達。 (4)成功構(gòu)建了pEGFP-N1-FEZ1真核重組質(zhì)粒、FEZ1 RNAi質(zhì)粒以及pET-28a-FEZ1原核表達重組質(zhì)粒，為進一步研究FEZ1對星形膠