氧糖剝奪對Cdh1蛋白表達(dá)的影響及其在星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均出現(xiàn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖這一病理過程。星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增殖對于神經(jīng)元甚至整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)而言,都是有利有弊的,其綜合效應(yīng)更傾向于有害的方面。研究腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖的具體機(jī)制并有效抑制其增殖,對于治療缺血性腦損傷具有重要的價值及意義。
　　細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物 APC及其調(diào)節(jié)亞基 Cdh1可以通過泛素化降解細(xì)胞周期蛋白從而抑制細(xì)胞增殖,同時 A

2、PC-Cdh1可以通過調(diào)節(jié)果糖-2,6-二磷酸酶3活性調(diào)控糖酵解代謝,而糖酵解代謝與細(xì)胞增殖互為促進(jìn)因素,另一方面大鼠全腦缺血性損傷后海馬區(qū) Cdh1蛋白表達(dá)下降,因此我們推測,APC-Cdh1在缺血性腦損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖中發(fā)揮著重要作用,但其具體機(jī)制目前尚不清楚。
　　我們擬通過構(gòu)建密閉缺氧小室進(jìn)行氧糖剝奪的方法,在體外模擬缺血性腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增殖,并通過流式細(xì)胞技術(shù)及Realtime PCR法檢測細(xì)胞周期

3、及Cdh1 mRNA變化,以鑒定模型構(gòu)建成功;通過不同程度氧糖剝奪的處理,探討氧糖剝奪對星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi) Cdh1蛋白表達(dá)的影響,通過對比單純?nèi)毖跖c氧糖剝奪對Cdh1蛋白表達(dá)的影響評估糖代謝與 Cdh1蛋白表達(dá)之間的聯(lián)系;通過構(gòu)建表達(dá)大鼠Cdh1基因的重組慢病毒載體,調(diào)控 Cdh1活性;通過觀察 Cdh1慢病毒干預(yù)對其下游底物的影響以評估其功能,通過其對星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖的影響,探討 Cdh1在星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖中的作用。

4、　　研究方法與結(jié)果：
　　1.大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖模型的構(gòu)建及鑒定
　　方法:體外純化培養(yǎng)大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞,通過免疫組化法鑒定其純度;構(gòu)建密閉缺氧小室進(jìn)行氧糖剝奪處理,通過檢測不同時間點(10min,30min,1h,3h,6h,9h)小室內(nèi)氧含量及小室內(nèi) Earle's平衡液的氧分壓評估氧糖剝奪效果;對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪1h復(fù)氧48h處理,免疫組化雙標(biāo)法檢測其增殖效應(yīng);星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪3h,6h,9

5、h后,PI單染法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期改變,Realtime-PCR法檢測 Cdh1及其下游底物細(xì)胞周期蛋白 B1的mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果:體外成功培育的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度>90％;與對照組相比,缺氧小室進(jìn)行氧糖剝奪各組氧分壓均下降(P<0.05),與10min組相比,其余各組氧分壓均下降(P<0.05),30min組與1h,3h,6h,9h組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);通過氧糖剝奪1h復(fù)氧48h處理可引起星形膠質(zhì)細(xì)

6、胞的反應(yīng)性增殖,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);氧糖剝奪3h不引起細(xì)胞處于 S期的比例改變,6h,9h組處于S期的細(xì)胞明顯減少(P<0.05);氧糖剝奪3h不引起細(xì)胞內(nèi) Cdh1及CyclinB1 mRNA水平的變化,6h組 Cdh1 mRNA表達(dá)下降,CyclinB1 mRNA表達(dá)增多,與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.氧糖剝奪對星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi) Cdh1蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制研究
　　方

7、法:①體外純化培養(yǎng)大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞,隨機(jī)分為對照組,氧糖剝奪1h復(fù)氧組,氧糖剝奪6h復(fù)氧組,對照組常氧培養(yǎng),實驗組分別氧糖剝奪3h或6h后復(fù)氧48h,Western blot法檢測 Cdh1及其下游底物 Skp2蛋白的表達(dá)變化;②將體外純化培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為對照組,氧糖剝奪6h組,單純?nèi)毖?h組,分別進(jìn)行常氧,氧糖剝奪與單純?nèi)毖跆幚?6h后 Western blot法檢測 Cdh1蛋白的表達(dá)變化,血糖儀檢測各組培養(yǎng)液中葡

8、萄糖含量的變化。
　　結(jié)果:①與對照組相比,氧糖剝奪1h復(fù)氧組,氧糖剝奪6h復(fù)氧組 Cdh1蛋白表達(dá)均下降,Skp2蛋白表達(dá)均增加(P<0.05);②與對照組相比,氧糖剝奪6h組 Cdh1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05),單純?nèi)毖?h組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),氧糖剝奪6h組與單純?nèi)毖?h組兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);單純?nèi)毖?h組細(xì)胞外液葡萄糖攝取率低于對照組(P<0.05)。
　　3.表達(dá)大鼠Cdh1

9、基因的重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　方法:根據(jù)大鼠Cdh1基因的核苷酸序列,合成目的基因片段并亞克隆到慢病毒表達(dá)載體 pGC-FU的Age I酶切位點間,命名為 pGC-FU-Cdh1。對 pGC-FU-Cdh1進(jìn)行 PCR擴(kuò)增及測序鑒定。將 pGC-FU-Cdh1脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡及Western blot檢測其表達(dá)情況。慢病毒載體 LV-Cdh1的包裝濃縮及滴度測定。
　　結(jié)果:重組慢病毒表達(dá)載體

10、pGC-FU-Cdh1經(jīng)PCR擴(kuò)增、測序鑒定均顯示有特異性基因片斷,證明大鼠Cdh1基因正向插入慢病毒表達(dá)載體pGC-FU中;pGC-FU-Cdh1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡及Western blot檢測到Cdh1-GFP的表達(dá);慢病毒載體LV-Cdh1包裝濃縮后,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡觀測到Cdh1-GFP的表達(dá)后, Realtime PCR法測定滴度為2×108TU/ml。
　　4.慢病毒過表達(dá) Cdh1蛋白對

11、星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞反應(yīng)性增殖作用的初步研究
　　方法:體外純化培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞:①隨機(jī)分為 Cdh1慢病毒組及空病毒組,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá),Western Blot檢測 Cdh1及Skp2蛋白的表達(dá)變化;②隨機(jī)分為單純氧糖剝奪/復(fù)氧組,Cdh1慢病毒干預(yù)組,空病毒干預(yù)組,氧糖剝奪1h復(fù)氧48h后,CCK-8法及免疫組化雙標(biāo)法檢測細(xì)胞增殖的變化。
　　結(jié)果:與空病毒組相比,Cdh1慢病毒組 Cdh1蛋白表達(dá)總量

12、增加,Skp2蛋白表達(dá)下降(P<0.05);與單純氧糖剝奪/復(fù)氧組相比,Cdh1慢病毒干預(yù)組細(xì)胞反應(yīng)性增殖受到抑制(P<0.05),空病毒組沒有變化(P>0.05)。
　　研究結(jié)論：
　?、僭隗w外成功培育成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞;通過密閉缺氧小室成功進(jìn)行氧糖剝奪處理,30min后可達(dá)穩(wěn)態(tài),并維持缺氧狀態(tài)9h無差異;通過氧糖剝奪1h復(fù)氧48h處理引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增殖;星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖狀態(tài)不引起 Cdh1 mRNA水平的

13、改變。
　　②氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi) Cdh1蛋白表達(dá)減少,其變化與氧糖剝奪時間長短及是否復(fù)氧無關(guān);Cdh1蛋白水平的變化與氧糖剝奪時細(xì)胞外液中缺少葡萄糖有關(guān)。
　?、鄢晒?gòu)建表達(dá)大鼠Cdh1基因的重組慢病毒載體LV-Cdh1,包裝的病毒滴度為2×108TU/ml,能在蛋白水平上調(diào) Cdh1的表達(dá),對其下游底物 Skp2蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。
　　④慢病毒過表達(dá) Cdh1蛋白對氧糖剝奪再復(fù)氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增殖有