ADAR1在膠質(zhì)瘤中的表達及其功能研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是人體常見的惡性腫瘤之一,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤中擁有較高的死亡率。膠質(zhì)瘤在顱腦疾病的死亡率中,位于腦卒中之后,居第二位。目前在惡性程度最高的膠質(zhì)瘤中其中位生存期僅約為15.8個月,5年期生存率只約為9.6％。究其高死亡率的原因主要是因為膠質(zhì)瘤細胞具有高度的異型性、較強的生物侵襲性及對化放療等治療不敏感的特點。而目前由于對膠質(zhì)瘤發(fā)病機制尚未有完全的了解,所以尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療方案來治療膠質(zhì)瘤。因此深入的研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制已成為

2、治療膠質(zhì)瘤急需解決的問題。
　　而導致腫瘤產(chǎn)生的致癌作用是一個復雜的,多階段的過程,它是細胞在受外源性和內(nèi)源性的作用因子下共同發(fā)生發(fā)展所導致的結(jié)果。近年來,研究顯示DNA突變?yōu)樵S多癌癥的發(fā)生發(fā)展提供了重要的分子線索。特別是轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控事件,例如RNA編輯,正在成為研究包括人類腫瘤等多種疾病的新方向。ADARs酶家族能夠通過對轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的目標RNA序列進行將腺嘌呤脫氨基的作用,使腺嘌呤轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤,影響翻譯中堿基的配對,從而完成對

3、RNA的編輯。這種編輯的表達和活化在對正常細胞的精細調(diào)控中是必不可少的。
　　關(guān)于ADARs的RNA編輯在腫瘤領(lǐng)域的相關(guān)研究還主要集中在ADAR2上。目前研究認為,ADAR2與膠質(zhì)母細胞瘤的增殖和侵襲性密切相關(guān)。ADAR2可以通過作用于離子型谷氨酸受體(AMPAR亞型)mRNA的Q/R位點,進而改變AMPAR對Ca2+的通透性,使細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度降低,從而抑制了腫瘤的增殖和侵襲性。同時相關(guān)研究在檢測ADAR2在兒童膠質(zhì)母細胞瘤

4、上的表達時,發(fā)現(xiàn)ADAR1(p110)呈高表達。認為ADAR1(p110)可能和ADAR2形成異二聚體。從而影響ADAR2對AMPAR mRNA的編輯。但ADAR1與膠質(zhì)瘤凋亡與增殖的相關(guān)研究未見報道。而本實驗的研究目的在于檢測膠質(zhì)瘤中ADAR1的表達,以及探明在對人膠質(zhì)瘤細胞系進行ADAR1干涉后,膠質(zhì)瘤細胞系在增殖與凋亡等生物學行為上的改變,進而探明ADAR1在膠質(zhì)瘤的發(fā)展機制中所發(fā)揮的作用。
　　實驗一檢測ADAR1在不同類

5、型成人膠質(zhì)瘤中的表達
　　目的:對ADAR1在人膠質(zhì)瘤組織上的表達給予蛋白定性的檢測。
　　方法:通過Western-Blot和免疫組織化學等方法,檢測人膠質(zhì)瘤組織及其瘤旁正常組織中ADAR1的表達。
　　結(jié)果:ADAR1在膠質(zhì)瘤中的表達明顯高于其瘤周正常腦組織。
　　結(jié)論:本次試驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAR1在膠質(zhì)瘤中的高表達,表明其與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展,以及相關(guān)生物學功能存在一定的關(guān)聯(lián),為本實驗后期檢測干涉ADAR1后

6、的膠質(zhì)瘤細胞系的增殖力與凋亡率的變化提供了理論與研究基礎(chǔ)。為進一步探明ADAR1在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展以及對膠質(zhì)瘤的治療提供了新的理論基礎(chǔ)與研究方向。
　　實驗二檢測ADAR1在不同人膠質(zhì)瘤細胞系中的表達
　　目的:通過對4種經(jīng)典人膠質(zhì)瘤細胞系中ADAR1表達的檢測,選擇出一種或幾種ADAR1高表達的細胞系,作為后續(xù)研究ADAR1生物學功能的實驗對象。
　　方法:采用Western-Blot方法對4種人膠質(zhì)瘤細胞系中ADA

7、R1的表達進行蛋白水平半定量檢測。
　　結(jié)果:在對4種膠質(zhì)瘤細胞系進行ADAR1表達的檢測后發(fā)現(xiàn),T98G膠質(zhì)瘤細胞系中ADAR1的表達量最低,而U87,U251這兩種膠質(zhì)瘤細胞系中ADAR1的表達量較高, A172的表達量次之。
　　結(jié)論:發(fā)現(xiàn)本試驗研究結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)論一致,具有可靠性。因此后續(xù)試驗將選擇U87,U251這兩種膠質(zhì)瘤細胞系作為試驗對象,以探明ADAR1與膠質(zhì)瘤細胞凋亡和增殖的關(guān)系。
　　實驗三干涉A

8、DAR1在人膠質(zhì)瘤細胞系中表達
　　目的:通過ADAR1 shRNA對U87,U251這兩種膠質(zhì)瘤細胞系進行轉(zhuǎn)染,選擇最佳轉(zhuǎn)染效率的細胞系,并通過RT-PCR,Western-Blot等技術(shù),分別對轉(zhuǎn)染后的細胞系進行ADAR1的mRNA和蛋白量的檢測。最后選擇出干涉成功后的細胞系作為下一步檢測細胞增殖力與凋亡的實驗對象。
　　方法:運用ADAR1 shRNA對U87,U251這兩種膠質(zhì)瘤細胞系進行順轉(zhuǎn),待轉(zhuǎn)染24h,48h,

9、72h后通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率;然后根據(jù)熒光顯微鏡所觀察到的轉(zhuǎn)染效率,選取轉(zhuǎn)染效率最高的細胞系作為試驗對象;再通過RT-PCR,Western-Blot等技術(shù),分別對轉(zhuǎn)染后的細胞系進行mRNA和蛋白量的檢測。
　　結(jié)果:通過倒置熒光顯微鏡分別于轉(zhuǎn)染細胞24、48和72h后進行觀察,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48h時,ADAR1-shRNA的轉(zhuǎn)染效率最高,轉(zhuǎn)染72h后綠色熒光蛋白(EGFP)表達逐漸衰減,并發(fā)現(xiàn)大量細胞死亡;因此,選擇在對細胞轉(zhuǎn)染

10、48h時進行ADAR1 mRNA和蛋白表達進行檢測。對ADAR1-shRNA轉(zhuǎn)染48h的細胞進行RT-PCR和Wetern-Blot檢測,結(jié)果顯示ADAR1-shRNA干擾組ADAR1 mRNA和蛋白的表達水平明顯低于陰性對照組和空白組。
　　結(jié)論:結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48h時,ADAR1 shRNA轉(zhuǎn)染效率最高,因此后續(xù)試驗將選擇轉(zhuǎn)染48h的膠質(zhì)瘤細胞系作為試驗對象,以明確ADAR1對膠質(zhì)瘤細胞增殖與凋亡的影響。
　　實驗四檢測人

11、膠質(zhì)瘤細胞系在ADAR1干涉后的增殖率
　　目的:通過MTT法檢測上述兩種被順轉(zhuǎn)的經(jīng)典膠質(zhì)瘤細胞系的細胞增殖能力。
　　方法:取用ADAR1 shRNA進行轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞系,用MTT法檢測這兩種細胞系的增殖率。
　　結(jié)果:在用MTT法分別檢測經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12h、24h、48h、和72h后的膠質(zhì)瘤細胞系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAR1-shRNA干擾組與陰性對照組及空白對照組相比細胞增值率明顯降低。
　　結(jié)論:通過本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)

12、在進行了干涉ADAR1表達的膠質(zhì)瘤細胞系中,實驗組膠質(zhì)瘤細胞的增殖率較對照組明顯降低,因此認為在干涉 ADAR1的表達后能降低膠質(zhì)瘤細胞的增值率,而ADAR1的高表達與膠質(zhì)瘤細胞的高增殖率有密切關(guān)系,高表達的ADAR1有促進膠質(zhì)瘤細胞增殖的能力。
　　實驗五檢測人膠質(zhì)瘤細胞系在ADAR1干涉后的凋亡率
　　目的:通過流式細胞儀檢測上述兩種被順轉(zhuǎn)的經(jīng)典膠質(zhì)瘤細胞系的細胞凋亡水平。
　　方法:取用ADAR1 shRNA進行

13、轉(zhuǎn)染48h的膠質(zhì)瘤細胞系,用流式細胞儀法檢測這兩種細胞系的凋亡率。
　　結(jié)果:在用流式細胞術(shù)法檢測經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后的膠質(zhì)瘤細胞系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAR1-shRNA干擾組相比陰性對照組和空白對照組其細胞凋亡率明顯升高。
　　結(jié)論:通過本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在進行了ADAR1 shRNA轉(zhuǎn)染48h后的膠質(zhì)瘤細胞系中,其膠質(zhì)瘤細胞的凋亡率較對照組明顯升高,因此認為在干預ADAR1的表達后能促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡,而 ADAR1的高表達與膠質(zhì)