異常增高的ATAD2調(diào)節(jié)Hedghog通路關(guān)鍵基因影響肝癌的生物學(xué)行為.pdf

1、背景：
　　原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）以下簡(jiǎn)稱肝癌，是嚴(yán)重影響人類生存率的常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率占惡性腫瘤的第五位，病死率占癌腫死因的第三位，每年新發(fā)病例大約60萬人，大約55％來自于中國(guó)，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民生命健康的惡性腫瘤之一。肝癌術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)70％，其中80％的復(fù)發(fā)病灶發(fā)生在肝臟（肝內(nèi)轉(zhuǎn)移）成為肝癌病人術(shù)后死亡的主要原因。在臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)，一部分肝癌病人病程早期

2、即出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移或（和）遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移、或術(shù)后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，而有些病程晚期病人卻沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或切除后復(fù)發(fā)。因此，肝癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有其內(nèi)在的始動(dòng)、促發(fā)因素，對(duì)此我們還不甚了解。深入研究肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)規(guī)律及機(jī)制，尋找新的分子治療靶點(diǎn)，對(duì)提高療效、改善預(yù)后具有重要意義。
　　ATAD2(ATPase familyAAA domain-containing protein2)基因，定位于人染色體8q24.13，在一些腫瘤中參與調(diào)控染色質(zhì)

3、動(dòng)力活性、基因組轉(zhuǎn)錄活性和細(xì)胞凋亡過程。其編碼蛋白質(zhì)具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:AAA區(qū)域和溴區(qū)結(jié)構(gòu)域(Bromodomain)。AAA區(qū)域做為分子伴侶，執(zhí)行裝配、操作、分解蛋白復(fù)合物的功能;溴區(qū)結(jié)構(gòu)域參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其表達(dá)異常導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展。深入研究其作用機(jī)理將為腫瘤治療提供新的策略，有望成為新的腫瘤表面標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。
　　Hedgehog(Hh)信號(hào)通路是高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，近幾年發(fā)現(xiàn)，肝癌中存在

4、異常Hh信號(hào)，其在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。參與Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要成分有:Hh蛋白、Ptch1蛋白、Smo蛋白和Gli蛋白。膜受體蛋白Ptch1與分泌因子Hh結(jié)合后，促進(jìn)其共受體膜蛋白Smo構(gòu)相改變，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列包括Gli-1在內(nèi)的下游因子的激活。Ptch1是Hh信號(hào)通路的的關(guān)鍵基因，其表達(dá)強(qiáng)度在一定程度上可以代表Hh信號(hào)的活性程度，Gli是Hh信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，其過度表達(dá)可誘導(dǎo)Snail的活性，抑制E-鈣粘附素(E-c

5、adherin，E-cad)表達(dá)及上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表達(dá)，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。我們利用RNAi技術(shù)將高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株HCCLM3細(xì)胞中的ATAD2基因沉默，PCR Array基因芯片篩查結(jié)果顯示， Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵活性因子Ptch1基因表達(dá)顯著抑制。因此，我們推測(cè)ATAD2基因可能調(diào)控Ptch1表達(dá)，激活Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的

6、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，但其具體作用機(jī)制尚不清楚，有待我們進(jìn)一步研究。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　1.IHC檢測(cè)80例原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中ATAD2，Ptch1，SMO，Gli2的蛋白表達(dá)情況。
　　2.收集25例手術(shù)切除的新鮮肝癌組織標(biāo)本包括癌組織和癌旁組織，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)RIN1在mRNA的表達(dá)情況，并進(jìn)行分析對(duì)比。
　　3.肝癌細(xì)胞誅HCCLM3
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、細(xì)胞

7、培養(yǎng):人肝癌細(xì)胞株培養(yǎng)HCCLM3。
　　2、RealTimePCR檢測(cè)ATAD2，Ptch1，SMO，Gli2基因mRNA水平在組織中的表達(dá)和傳染前后細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3、免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝癌組織中ATAD2，Ptch1，SMO，Gli2蛋白表達(dá)水平。
　　4.Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后，HCCLM3細(xì)胞株中的ATAD2，Ptch1，SMO的蛋白水平表達(dá)
　　5、應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATAD

8、2沉默表達(dá)后肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力變化。
　　6、應(yīng)用細(xì)胞周期試劑盒檢測(cè)ATAD2沉默表達(dá)后肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分 ATAD2基因在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及臨床意義
　　1、PCR結(jié)果顯示25例肝癌標(biāo)本中ATAD2，Ptch1，SMO，Gli2在肝癌組織中表達(dá)高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織。
　　2 IHC結(jié)果顯示ATAD2，Ptch1，SMO，Gli2在肝癌組織中呈高表達(dá)(54/80，67.5％

9、),(44/80,,55％),(42/80,52.5％),(58/80,72.5％)。
　　3.肝癌組織ATAD2表達(dá)變化與臨床病理因素結(jié)果顯示，ATAD2、Ptch1、Gli2表達(dá)與增殖轉(zhuǎn)移(P＜0.05)密切相關(guān);多因素分析顯示ATAD2，Ptch1，Gli2高表達(dá)能夠獨(dú)立預(yù)示肝癌病人術(shù)后生存率低，預(yù)后差。
　　第二部分 ATAD2基因沉默后對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　1、沉默表達(dá)ATAD2基因，RealTim

10、ePCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HCCLM3細(xì)胞中ATAD2，Ptch1，SMO，Gli2的mRNA的表達(dá)均被抑制。
　　2.WesternBlot結(jié)果與PCR結(jié)果趨勢(shì)一致。
　　3.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCCLM3細(xì)胞侵襲及遷移能力下。
　　4.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默表達(dá)ATAD2基因，細(xì)胞周期出現(xiàn)停止，阻滯于G1/S期。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默ATAD2基因后，HCCLM3細(xì)胞凋亡率顯著升高。