ATAD2影響上皮性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制.pdf

1、卵巢癌是婦科常見的三大惡性腫瘤之一，由于卵巢癌發(fā)病和進(jìn)展隱匿，早期多無明顯癥狀，缺乏普查和行之有效的措施，就診時(shí)70％已屬晚期。目前，卵巢癌的治療方法有手術(shù)、化療、放療及生物治療等，但是5年生存率徘徊在30％左右。上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer, EOC)是卵巢癌中最常見類型，也是婦科腫瘤中病死率最高的腫瘤類型，其病死率高于其他所有婦科腫瘤之和。究其根源，對卵巢癌的早期診斷困難，目前還沒有有效的基因治療

2、靶點(diǎn)，是導(dǎo)致治療失敗的主要原因，并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。研究表明，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程，因此，從分子水平積極尋找卵巢癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，對于研究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制并探尋新的生物治療靶點(diǎn)具有重要的意義。
　　ATAD2(ATPase family AAA domain containing protein2)基因，又名ANCCA(AAA+ nuclear coregulator cancer associa

3、ted)基因?qū)儆?，ATP酶基因家族，定位于人8q24，其主要特點(diǎn)是，其編碼蛋白由一個(gè)約220個(gè)氨基酸組成的保守序列，包含一個(gè)ATP酶結(jié)合位點(diǎn)。該家族蛋白都至少包含一個(gè)或兩個(gè)AAA(ATPaseassociated with diverse celluar activities)結(jié)構(gòu)域。由ATAD2編碼的蛋白都含有2個(gè)AAA結(jié)構(gòu)域和一個(gè)溴區(qū)(Bromodomain)結(jié)構(gòu)域。AAA家族蛋白一般作為分子伴侶，通常執(zhí)行協(xié)助裝配，操作或分解蛋白質(zhì)

4、復(fù)合物的功能。溴區(qū)結(jié)構(gòu)域是進(jìn)化上高度保守的由110個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域，可特異識別組蛋白末端乙酰化的賴氨酸位點(diǎn)，通過染色質(zhì)的組裝和乙?；瘏⑴c信號依賴性的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，也可通過轉(zhuǎn)錄因子非轉(zhuǎn)錄蛋白的乙?；揎椂鴱V泛參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。溴區(qū)結(jié)構(gòu)域蛋白通過組蛋白的乙酰化的失調(diào)控參與了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目前ATAD2在上皮性卵巢癌的研究很少，深入研究ATAD2在上皮性卵巢癌中的作用機(jī)理，為上皮性卵巢癌的治療提

5、供新的分子靶點(diǎn)。
　　目的:
　　本研究旨在探討ATAD2在上皮性卵巢癌中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系、卵巢癌的預(yù)后分析及其在卵巢細(xì)胞系中的生物學(xué)行為，為臨床治療提供新的思路及依據(jù)。研究的第一部分，我們在組織水平上檢測ATAD2的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征的關(guān)系;研究的第二部分，通過基因沉默ATAD2表達(dá)，觀察對其增殖和侵襲能力的影響，揭示ATAD2與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　方法:
　　一、實(shí)

6、驗(yàn)對象
　　2008年1月～2013年12月，中國醫(yī)科大學(xué)病理科上皮性卵巢癌患者癌和正常卵巢組織配對組織病理切片110對;2013年1月～2013年12月，30例卵巢癌新鮮組織標(biāo)本和30例正常卵巢組織;1株正常卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC，2株卵巢癌細(xì)胞OVCAR3、HO8910。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1.免疫組織化學(xué)SP法檢測卵巢癌和正常卵巢組織中ATAD2蛋白表達(dá)水平。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng):人卵巢癌細(xì)胞株和人正

7、常卵巢上皮細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)。
　　3.Real Time PCR檢測ATAD2基因mRNA在組織和細(xì)胞水平的表達(dá)。
　　4.Western blot檢測3株細(xì)胞及卵巢癌和正常卵巢組織中ATAD2蛋白表達(dá)。
　　5.應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測ATAD2沉默表達(dá)后細(xì)胞增殖能力的變化。
　　6.應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測ATAD2沉默表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移能力變化。
　　7.應(yīng)用細(xì)胞周期試劑盒檢測ATAD2沉默表達(dá)后卵

8、巢癌細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果:
　　第一部分 ATAD2在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義
　　1.免疫組化結(jié)果顯示，ATAD2在卵巢癌組織中高表達(dá)。
　　2.Western Blot結(jié)果與PCR結(jié)果趨勢一致，ATAD2在上皮性卵巢癌高表達(dá)。
　　3.卵巢癌組織ATAD2表達(dá)變化與臨床病理特征相關(guān)性顯示，ATAD2表達(dá)與腫瘤分期、網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、腹水及CA125(p＜0.05)密切相關(guān);而與年齡、病理類型、病理分級

9、、殘余腫瘤大小無明顯相關(guān)(p＞0.05)。
　　4.Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果表明:ATAD2低表達(dá)的患者生存狀態(tài)較好，ATAD2高表達(dá)的患者生存狀態(tài)較差。
　　5.Cox模型多因素分析結(jié)果表明， ATAD2的表達(dá)和CA-125，生存率的關(guān)鍵因素。
　　第二部分 基因沉默ATAD2在卵巢癌細(xì)胞中的生物學(xué)特征
　　1.Real Time PCR及Western Blot結(jié)果顯示，ATAD2在2株卵巢癌細(xì)胞

10、中的表達(dá)水平高于正常卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC，且在OVCAR3細(xì)胞株表達(dá)明顯升高。
　　2.沉默表達(dá)ATAD2基因，Transwell和MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩株細(xì)胞侵襲及遷移能力下降;CCK8及平板克隆實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞增殖能力及克隆形成能力下降;細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默表達(dá)ATAD2基因，細(xì)胞周期未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。
　　結(jié)論:
　　1.我們發(fā)現(xiàn)相對正常卵巢組織，ATAD2卵巢癌組織表達(dá)明顯升高。
　　2.ATAD2的