蛇床子素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　急性肺損傷(acutelunginjury,ALI)具有很高的發(fā)病率,當(dāng)其進(jìn)一步加重則發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS),其致死率高達(dá)40％。研究發(fā)現(xiàn),多種細(xì)胞與體液因素參與了ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,但其具體機(jī)制目前尚不明確。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分,在肺部感染和膿毒血癥中起

2、到重要作用,是ALI/ARDS的常見(jiàn)致病因素。由于ALI/ARDS居高不下的病死率,尋找其合適的治療靶點(diǎn)就顯得非常必要。
　　蛇床子素(Osthol,Ost)是一類最先從傘形科植物中提取分離出的天然香豆素類化合物,其化學(xué)名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素,具有廣泛的藥理學(xué)治療作用,近年發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗肝炎、抗骨質(zhì)疏松、抗過(guò)敏及雌激素樣作用,而且,進(jìn)一步研究表明,蛇床子素可抑制炎癥介質(zhì)的釋放。然而,目前尚不清楚蛇床子素是否對(duì)A

3、LI有保護(hù)作用。近些年來(lái),許多研究已報(bào)道了腎素-血管緊張素系統(tǒng)在重癥急性肺損傷中的重要作用,其中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensinconvertingenzyme2,ACE2)與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensinconvertingenzyme,ACE)作用相反,可下調(diào)血管緊張素II(angiotensinII,AngII)的表達(dá),表明其是嚴(yán)重肺水腫和急性肺衰竭中關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。因此,我們假設(shè)蛇床子素可能對(duì)急性肺損傷有

4、保護(hù)作用,這種作用與ACE2的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬觀察Ost對(duì)LPS所致小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用,進(jìn)而深入研究其可能的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　(1)觀察蛇床子素對(duì)LPS導(dǎo)致的ALI的保護(hù)作用
　　(2)觀察蛇床子素是否通過(guò)抑制ACE2和Ang(1-7)表達(dá)的下調(diào)進(jìn)而減輕LPS導(dǎo)致的ALI
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　為觀察Ost對(duì)LPS導(dǎo)致動(dòng)物死亡率的影響,成年雄性BA

5、LB/c小鼠(18~22g)采用腹腔注射脂多糖(50mg/kg)造成小鼠內(nèi)毒素血癥模型,并將其隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(n=20)、LPS組(n=20)、Ost20mg/kg+LPS組(n=20)及Ost40mg/kg+LPS組(n=20)。在Ost20mg/kg+LPS組和Ost40mg/kg+LPS組,LPS注射前給予連續(xù)四天的Ost(20或40mg/kg)灌胃。小鼠注射LPS后,每6小時(shí)記錄一次小鼠的死亡情況,連續(xù)記錄72h。

6、　　成年雄性BALB/c小鼠(18~22g)隨機(jī)分為4組,分別為:生理鹽水(NS)對(duì)照組(n=12),Ost對(duì)照組(n=12),LPS組(n=12)及Ost+LPS組(n=12)。在LPS組,給予小鼠氣管滴注LPS(5mg/kg);NS組與Ost組,小鼠分別給予生理鹽水或蛇床子素灌胃;在Ost+LPS組,LPS氣管滴注前4天每天給予Ost灌胃(40mg/kg),最后一次灌胃后1小時(shí)給予LPS處理。在NS或LPS滴注后6小時(shí)取小鼠右肺進(jìn)行

7、病理觀察,檢測(cè)肺組織勻漿中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)的mRNA及蛋白表達(dá)情況并檢測(cè)血管緊張素1-7[Ang(1-7)]的濃度,免疫組織化學(xué)觀察肺組織中ACE2與Ang(1-7)的表達(dá)情況,制備并測(cè)定小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)中蛋白的含量、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)的表達(dá)水平,取小鼠左肺,測(cè)肺濕/干重比值(W/D)。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　

8、將大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系NR8383細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板(Ham’sF12培養(yǎng)基與15%胎牛血清),培養(yǎng)至一定數(shù)量后換成無(wú)血清培養(yǎng)基,給予ACE2抑制劑DX-600(100nM)的情況下用50μg/ml的Ost處理4小時(shí),然后用LPS(1μg/ml)刺激細(xì)胞12小時(shí),收取上清液測(cè)定TNF-α和IL-6的含量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　為評(píng)估蛇床子素對(duì)小鼠內(nèi)毒素血癥的保護(hù)作用,在LPS注射前每天給予小鼠蛇床子素灌

9、胃(20或40mg/kg),連續(xù)4天,預(yù)處理高劑量的蛇床子素(40mg/kg)后,小鼠3天的死亡率為45%,與LPS組(75%)相比,其死亡率顯著降低(P<0.05);而低劑量蛇床子素(20mg/kg)預(yù)處理組小鼠3天死亡率(65%)與LPS組無(wú)明顯差異(P=0.47)。以上數(shù)據(jù)表明Ost預(yù)處可明顯降低內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率,且其效果有劑量依賴性。因此采用40mg/kg的蛇床子素進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。
　　組織病理形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),

10、LPS組肺組織中充血與水腫明顯增多并有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而預(yù)處理Ost后可使LPS所致的肺損傷明顯減輕,肺組織結(jié)構(gòu)接近正常;同時(shí),LPS組小鼠左肺W/D、肺泡灌洗液中蛋白含量、TNF-α和IL-6的表達(dá)相比于對(duì)照組均與明的升高(P<0.05),但在Ost+LPS組上述指標(biāo)顯著降低(P<0.05)。
　　在LPS組,小鼠肺組織勻漿中Ang(1-7)濃度為(142.4±5.905)ng/L,低于正常對(duì)照組(165.8±10.62)n

11、g/L,而在Ost+LPS組升至(157.2±6.247)ng/L,與LPS組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。LPS組小鼠肺組織勻漿中ACE2mRNA表達(dá)低于正常對(duì)照組(P<0.05);而在Ost+LPS組其表達(dá)量升高,與LPS組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。Westernblotting與免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示LPS能顯著降低肺組織中ACE2和Ang(1-7)的含量;而在Ost預(yù)處理后,ACE2和Ang(1-7)的減少程度明顯減輕。正常對(duì)照組與蛇

12、床子素對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　結(jié)果顯示蛇床子素預(yù)處理可抑制LPS導(dǎo)致的細(xì)胞上清中TNF-a和IL-6含量的升高。但是加入ACE2抑制劑DX-600后,減弱了Osth抑制LPS導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞細(xì)胞(NR8383)培養(yǎng)液上清中TNF-a和IL-6的升高作用。
　　結(jié)論:
　　(1)蛇床子素對(duì)LPS導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷有保護(hù)作用。
　　(2)蛇床子素可抑制LPS所致的NR8383細(xì)胞分泌的炎癥因子