LRRFIP2和CD11b負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答及其作用機(jī)制研究.pdf

1、無論是在天然免疫還是適應(yīng)性免疫中，對(duì)于負(fù)向調(diào)控分子和負(fù)向調(diào)控機(jī)制的研究是近年來免疫學(xué)研究領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)，通過開展這方面的研究既能夠更好地認(rèn)識(shí)免疫系統(tǒng)的作用方式，也能夠?yàn)橄嚓P(guān)疾病的治療提供新的思路。我們前期的研究表明，LRRFIP2與CD11b對(duì)于免疫應(yīng)答具有負(fù)向調(diào)控作用，本課題就這兩個(gè)分子發(fā)揮各自免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控功能與相應(yīng)的作用機(jī)制開展了研究。
　　 第一部分LRRFIP2負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體的活化及其分子機(jī)制研究

2、r>　　 炎性細(xì)胞因子IL-1β在天然免疫中發(fā)揮著重要的作用，它的產(chǎn)生過程中既需要編碼蛋白的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)生前體，也需要一類叫做炎性復(fù)合體(inflammasome)的分子復(fù)合物將它剪切成為成熟體。炎性復(fù)合體種類有很多，目前研究最為集中的是一類叫做NLRP3的炎性復(fù)合體(NLRP3inflanmmasome)，它是由模式識(shí)別受體NLRP3與接頭分子ASC以及效應(yīng)分子Caspase-1所構(gòu)成的，在一些病原體相關(guān)分子或危險(xiǎn)信號(hào)相關(guān)分子的刺

3、激下三者形成復(fù)合體并活化Casspase-1，使其行使剪切IL-1β的功能。為了進(jìn)一步研究NLRP3炎性復(fù)合體的活化與條件過程，我們利用免疫共沉淀技術(shù)與液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)，尋找和NLRP3炎性復(fù)合體相互作用的蛋白，并找到了LRRFIP2分子在LPS+ATP刺激后能夠與NLRP3炎性復(fù)合體的接頭蛋白ASC結(jié)合。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中用siRNA干擾LRRFIP2表達(dá)后，NLRP3炎性復(fù)合體相關(guān)刺激引起的細(xì)胞分泌IL-1

4、β會(huì)增加，而且這種增加是由于NLRP3炎性復(fù)合體活化水平升高導(dǎo)致IL-1β剪切加快所引起的，而對(duì)IL-1β前體合成過程沒有影響。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)LRRFIP2能夠在活化NLRP3炎性復(fù)合體的刺激后通過其N端氨基酸序列和NLRP3結(jié)合，進(jìn)而和整個(gè)NLRP3炎性復(fù)合體相互作用。在THP-1中過表達(dá)LRRFIP2的實(shí)驗(yàn)表明，其N端序列和中部的Coilmotif對(duì)其負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化是必須的。接著我們用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)

5、LRRFIP2能夠通過Coilmotif與FlightlessI分子結(jié)合。進(jìn)一步研究FlightlessI在炎性復(fù)合體中的功能，我們發(fā)現(xiàn)用siRNA干擾小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的FlightlessI后，活化炎性復(fù)合體的刺激引起的IL-1β的分泌水平與Capase-1的活化水平都升高。通過干擾與免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)LRRFIP2能夠在NLRP3炎性復(fù)合體活化之后促進(jìn)FlightlessI與NLRP3炎性復(fù)合體的結(jié)合并促進(jìn)其發(fā)揮抑制炎性復(fù)合

6、體活性的功能。最后，當(dāng)我們?cè)赥HP-1細(xì)胞中干擾掉FlightlessI的表達(dá)之后，再過表達(dá)LRRFIP2就不能抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活性，證明了LRRFIP2發(fā)揮抑制功能需要依賴于FlightlessI。綜上所述，本研究結(jié)果提示，LRRFIP2是NLRP3炎性復(fù)合體的一個(gè)負(fù)向調(diào)控分子，能夠通過N端與NLRP3相互作用并促進(jìn)FlightlessI與NLRP3炎性復(fù)合體的結(jié)合來抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活化以及IL-1β的剪切成熟。<

7、br>　　 第二部分整合素CD11b通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10減輕炎癥反應(yīng)及其機(jī)制的研究
　　 整合素在炎癥反應(yīng)與淋巴細(xì)胞遷移方面有重要作用，作為高表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞上的整合素的α亞基CD11b在調(diào)控免疫反應(yīng)方面的功能研究還不是很深入。在本實(shí)驗(yàn)室之前的工作中我們發(fā)現(xiàn)整合素CD11b能夠通過活化Syk引起TRIF和MyD88的降解來負(fù)向調(diào)控Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路活化引起的炎癥反應(yīng)。白細(xì)胞介素10(IL-10)是天然

8、免疫與適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，它能夠在TLR通路活化后上調(diào)表達(dá)從而參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控過程，關(guān)于CD11b與TLR活化誘導(dǎo)的IL-10上調(diào)表達(dá)之間的關(guān)系還沒有被報(bào)道過。在本研究中我們首先發(fā)現(xiàn)CD11b缺陷小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞在Toll樣受體3，4，9(TLR3，4，9)的配體Poly(I：C)，LPS和CpG-ODN刺激下IL-10的表達(dá)上升明顯受到抑制。進(jìn)一步利用抑制劑與過表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD11b主要通過磷酸化巨噬細(xì)胞中的

9、酪氨酸激酶Src從而活化PI3K/Akt通路來來增強(qiáng)TLR活化引起的IL-10上調(diào)表達(dá)。Src活化后，能夠與PI3K的p85亞基結(jié)合并使其磷酸化并促進(jìn)E3泛素連接酶c-Cb1介導(dǎo)的p85的降解，從而引起PI3K/Akt信號(hào)通路的活化。PI3K/Akt的活化能夠引起下游分子GSK3α/β的磷酸化與活性的抑制，從而解除其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CREB轉(zhuǎn)錄活性的抑制功能，進(jìn)而促進(jìn)IL-10的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在DSS誘導(dǎo)的腸炎模型中，CD11b缺陷小

10、鼠有更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，同時(shí)血清中IL-10的含量以及腸系膜淋巴結(jié)與脾臟中CD4+Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例低于同窩對(duì)照?？偠灾谕ㄟ^本研究，我們發(fā)現(xiàn)了巨噬細(xì)胞上的CD11b對(duì)TLR活化引起的IL-10表達(dá)上調(diào)有促進(jìn)作用，而這種促進(jìn)作用是通過CD11b活化其下游激酶Src經(jīng)由PI3K/Akt通路以及其下游的GSK3α/β的一系列信號(hào)傳遞來實(shí)現(xiàn)的，另外我們還發(fā)現(xiàn)在小鼠DSS誘導(dǎo)的炎性腸病中，CD11b缺陷小鼠炎性腸病更加嚴(yán)重，同時(shí)血