HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列的功能研究及其在核酸疫苗中的應(yīng)用.pdf

1、HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列(HPRE)是乙肝病毒(HBV)基因組中在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)HBV基因表達(dá)的調(diào)控序列，廣泛存在的細(xì)胞核因子即HPRE結(jié)合蛋白與該序列結(jié)合能促進(jìn)mRNA向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)病毒基因的復(fù)制和表達(dá)，同時，由某些細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的HPRE抑制性結(jié)合蛋白與該序列某些位置結(jié)合，抑制此環(huán)節(jié)，從而阻礙病毒基因的復(fù)制和表達(dá)。 豬囊蟲是豬帶絳蟲的幼蟲，在人體內(nèi)寄生可引起囊蟲病。有關(guān)豬囊蟲病疫苗的研制有許多方法，包括蟲體來源的天然

2、抗原或重組抗原，蛋白亞單位疫苗，以及核酸疫苗。90年代發(fā)展起來的核酸疫苗具有能夠激發(fā)機體全面免疫發(fā)應(yīng)、不散毒、便于儲存和運輸?shù)葍?yōu)點，具有潛在的應(yīng)用價值，但其潛在的危險性也是關(guān)注的焦點。已有研究證明以豬囊蟲共同抗原基因制備的核酸疫苗具有良好的保護(hù)率。 本研究首先以熒光素酶(luciferase，LUC)基因為報告基因，將HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列(HPRE)以及缺失不同功能區(qū)域的HPRE片段插入報告基因下游，構(gòu)建以下真核表達(dá)質(zhì)粒： pc

3、DNA3.0-luc、pcDNA3.0-luc-HPRE、 pcDNA3.0-luc-HPREβ<,1>β<,2>、pcDNA3.0-luc-HPREαβ<,2>及pcDNA3.0-luc-HPREαβ<,1>，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，以重組人IFN-α作為誘導(dǎo)產(chǎn)生HPRE抑制性結(jié)合蛋白的刺激因子，在IFN-α作用前后，熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性的變化。發(fā)現(xiàn)缺失功能區(qū)域β<,2>后，IFN-α作用前后的熒光素酶活性變化不明顯，說明HPRE抑

4、制性結(jié)合蛋白主要與β<,2>發(fā)生作用。 在搞清楚HPRE抑制性結(jié)核蛋白結(jié)合區(qū)域后，將不含此區(qū)域的HPRE片段插入豬囊蟲核酸疫苗pPCV中，構(gòu)建核酸疫苗pPCV-HP，免疫小鼠，測抗體滴度，并于兩周后用豬絳蟲卵攻擊，三個月后解剖觀察豬囊尾蚴數(shù)，結(jié)果顯示核酸疫苗pPCV-HP的抗體滴度高于核酸疫苗pPCV，其保護(hù)率也比核酸疫苗pPCV的保護(hù)率高8％。采集豬各組織和豬舍環(huán)境中的糞便及土壤樣品，提取各組織的總DNA和卡那抗性菌的質(zhì)粒，P