shRNA表達(dá)框的快速制備及其在抗HBV相關(guān)研究中的應(yīng)用.pdf

1、慢性HBV感染的抗病毒治療一直是醫(yī)學(xué)界的重大難題,現(xiàn)有干擾素和拉米夫定的臨床療效有限,不斷嘗試進(jìn)行的其它治療方法,至今又尚無(wú)令人滿意的結(jié)果,RNA干擾技術(shù)的出現(xiàn),為處于困鏡的研究又帶來一線新的希望.在該研究第一部分著重探索建立簡(jiǎn)單高效的重疊延伸一步PCR方法,以能夠保質(zhì)保量地構(gòu)建和擴(kuò)增SEC,并以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)作為靶基因,證實(shí)PCR制備的SEC 用于

2、瞬時(shí)RNAi效應(yīng)研究及有效siRNA篩選的可行性.在該研究第一部分著重探索建立簡(jiǎn)單高效的重疊延伸一步PCR方法,以能夠保質(zhì)保量地構(gòu)建和擴(kuò)增SEC,并以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)作為靶基因,證實(shí)PCR制備的SEC 用于瞬時(shí)RNAi效應(yīng)研究及有效siRNA篩選的可行性.大規(guī)模siRNA篩選工作還取決于簡(jiǎn)便易行、快速準(zhǔn)確的效應(yīng)報(bào)告系統(tǒng).目前應(yīng)用最為廣泛的是熒光蛋白,它

3、通過易于檢測(cè)的熒光表達(dá)來反映與之融合的目標(biāo)基因表達(dá)情況.以此建立的致病基因表達(dá)報(bào)告系統(tǒng),使包括siRNA在內(nèi)各種基因治療方法的效果評(píng)估變得方便而高效.在該研究第二部分,我們即以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作為報(bào)告分子建立HBx瞬時(shí)表達(dá)的快速報(bào)告系統(tǒng),并運(yùn)用第一部分介紹的重疊延伸一步PCR法制備針對(duì)細(xì)胞外源致病基因HBx的shRNA表達(dá)框,初步建立了HBx-siRNA