HBV人工轉(zhuǎn)錄因子的制備及其抑制HBV復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:構(gòu)建可靶向性識(shí)別HBV增強(qiáng)子的鋅指蛋白(zinc fingerprotein，ZFP)人工轉(zhuǎn)錄因子（Artificial Transcription Factor，ATF）真核表達(dá)載體，檢測(cè)其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、對(duì)細(xì)胞增殖影響及生物學(xué)活性分析，通過(guò)靶向性識(shí)別HBV增強(qiáng)子來(lái)抑制HBV DNA復(fù)制與表達(dá)作用，為探索防治HBV感染的方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:(1) ATF真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3.1-ATF的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。(

2、2)將pcDNA3.1-ATF轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，采用RT-PCR、免疫熒光及Western-blot檢測(cè)ATF mRNA與蛋白的表達(dá);采用CCK-8檢測(cè)不同濃度的ATF對(duì)細(xì)胞增殖的影響;應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)ATF對(duì)HBV增強(qiáng)子靶序列的抑制作用。(3)通過(guò)pcDNA3.1-ATF轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，采用免疫熒光檢測(cè)ATF在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，同時(shí)評(píng)價(jià)ATF對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，分別利用熒光定量、Western-blot、RT-P

3、CR方法檢測(cè)對(duì)HBV DNA復(fù)制與表達(dá)的抑制作用。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建pcDNA3.1-ATF真核表達(dá)質(zhì)粒載體。(2) ATF在HepG2細(xì)胞中能夠正常表達(dá)且對(duì)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)無(wú)明顯的毒性作用;雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析ATF能靶向性結(jié)合HBV增強(qiáng)子序列，具有抑制報(bào)告基因的表達(dá)的作用。(3)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ATF表達(dá)質(zhì)粒于HepG2.2.15細(xì)胞，成功驗(yàn)證ATF具有抑制HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV DNA復(fù)制與表達(dá)的作