抑癌基因肺癌腫瘤抑制物1(TSLC1)對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞株生長(zhǎng)和凋亡的影響.pdf

1、[目的]
　　 構(gòu)建新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因肺癌腫瘤抑制物1(TSLC1)真核表達(dá)載體及探討重組載體對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞株生長(zhǎng)和凋亡的影響,為進(jìn)一步明確抑癌基因TSLC1對(duì)食管癌可能的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.TSLC1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 1.1根據(jù)GenBank提供的TSLC1基因的cDNA序列,設(shè)計(jì)特異性引物,用RT-PCR擴(kuò)增TSLC1的ORF,克隆至pMD19-

2、T simple載體中,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliJM109中,雙酶切鑒定篩選陽性克隆,進(jìn)行序列測(cè)定。再將其回收后連接入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli JM109中篩選。
　　 1.2取陽性重組真核表達(dá)載體擴(kuò)增抽取質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切鑒定后,陽性重組載體命名為pIRES2-EGFP-TSLC1,并雙酶切鑒定分析證實(shí)。
　　 2.TSLC1基因?qū)θ耸彻馨〦ca-109細(xì)胞株生長(zhǎng)和凋亡的影響<

3、br>　　 2.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞并鑒定TSLC1基因表達(dá)
　　 采用陽性脂質(zhì)體Lipofectamine2,000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-TSLC1載體和空白pIRES2-EGFP載體至食管癌Eca-109細(xì)胞中,命名轉(zhuǎn)染有pIRES2-EGFP-TSLC1的食管癌Eca-109細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,轉(zhuǎn)染有pIRES2-EGFP的食管癌Eca-109細(xì)胞為陽性對(duì)照組,野生型食管癌Eca-109細(xì)胞為空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)

4、后抽取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA,通過RT-PCR檢測(cè)TSLC1的mRNA表達(dá)情況。
　　 2.2指標(biāo)檢測(cè)
　　 2.2.1觀察轉(zhuǎn)染后48小時(shí)三組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變
　　 2.2.2 MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染后12～72小時(shí)三組細(xì)胞增殖與抑制
　　 2.2.3流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染后48小時(shí)三組細(xì)胞的細(xì)胞周期
　　 2.2.4采用Annexin-V/PI雙染法測(cè)定轉(zhuǎn)染后48小時(shí)三組細(xì)胞的凋亡
　　 [結(jié)果]

5、>　　 1.pIRES2-EGFP-TSLC1的構(gòu)建和鑒定
　　 RT-PCR擴(kuò)增獲得約1400bp的TSLC1基因ORF,經(jīng)限制性酶切鑒定證實(shí)后成功插入pIRES2-EGFP-TSLC1真核表達(dá)載體中。重組體pIRES2-EGFP-TSLC1經(jīng)測(cè)序及Bg1Ⅱ/EcoRⅠ雙酶切鑒定后得到與GenBank提供的TSLC1基因的cDNA序列(AY358334)高度同源。
　　 2.pIRES2-EGFP-TSLC1轉(zhuǎn)染后的

6、鑒定
　　 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后24、48和72小時(shí),通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞帶有綠色熒光;轉(zhuǎn)染48小時(shí)后通過RT-PCR測(cè)定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中TSLC1基因的表達(dá),結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組存在TSLC1基因表達(dá)。
　　 3.細(xì)胞形態(tài)變化
　　 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈圓形或橢圓形,聚集成團(tuán),細(xì)胞團(tuán)之間疏散,細(xì)胞狀態(tài)較差;對(duì)照組和空白組細(xì)胞呈多邊形或梭形,細(xì)胞之間交織緊密,細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。
　　 4.MTT檢測(cè)結(jié)果<

7、br>　　 MTT結(jié)果顯示:與對(duì)照組和空白組比較,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,增殖受到明顯抑制。
　　 5.細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果
　　 結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例(74.47％±1.89%)明顯高于對(duì)照組(64.33±2.87,P＜0.01)和空白組(63.77±3.06,P＜0.01),而S期細(xì)胞比例(8.23%±4.24%,P＜0.05)降低,表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期發(fā)生了G0/G1期阻滯。
　　 6.細(xì)胞凋亡