抑制S100A7基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞Eca-109侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響_3371.pdf

1、背景與目的:食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）在中國(guó)每年新診斷病例約有25萬(wàn)而且世界上食管癌病死率最高的國(guó)家也為中國(guó)。我國(guó)食管癌總發(fā)病率為22.14/100,000，死亡率為16.77/100,000，位居癌癥死因第四位,尤其是中晚期患者行手術(shù)治療后總的5年生存率不足10％，但TNM分期較早的患者及時(shí)行外科手術(shù)根治性切除后，其5年生存率能夠達(dá)到90%以上。因此，提高生存率的關(guān)

2、鍵就在于早期診斷及治療，而尋找鑒定食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因子及其作用的分子機(jī)制，對(duì)于其早期診斷及靶向治療均具有重要而深遠(yuǎn)的意義。目前研究證實(shí)包括食管鱗癌在內(nèi)的多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）具有密切聯(lián)系，EMT的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟為轉(zhuǎn)錄因子snail通過(guò)與E-cadheirn啟動(dòng)子區(qū)的E盒結(jié)合下調(diào)E-cadheirn的表達(dá)。
　　目前大量的

3、研究資料表明，鈣調(diào)節(jié)蛋白S100A7在多種惡性腫瘤組織中存在高表達(dá)（如頭頸部鱗癌、食管癌、胃癌、宮頸癌等），可能參與了腫瘤細(xì)胞的增殖分化、發(fā)生發(fā)展，然而在食管鱗癌的研究中對(duì)其機(jī)體的分子機(jī)制及各影響因子之間的相互作用卻缺少深入細(xì)致的研究。本項(xiàng)研究中，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time-PCR)及免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)驗(yàn)證S100A7 mRNA和其相應(yīng)功能蛋白在食管鱗癌組織、癌旁組織和正常食管組

4、織中的表達(dá)水平，然后依據(jù)S100A7 mRNA及其蛋白的具體表達(dá)水平進(jìn)一步分析臨床病理參數(shù)與二者表達(dá)量之間的相互關(guān)系及其臨床意義；然后運(yùn)用RNAi技術(shù)敲減S100A7在食管鱗癌細(xì)胞系Eca-109中的表達(dá)，研究其表達(dá)量下調(diào)后對(duì)食管癌細(xì)胞體外增殖和侵襲能力的影響；進(jìn)一步研究S100A7表達(dá)下調(diào)對(duì)E-cadheirn, vimentin和snail表達(dá)的影響，探討其與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制之間的相互關(guān)系；最終建立裸鼠移植瘤模型，并觀察S10

5、0A7 si-RNA注射對(duì)荷瘤模型的影響。
　　總之本研究以S100A7作為研究的分子靶點(diǎn)，利用Real Time-PCR、免疫組化及小分子RNA干擾等技術(shù)對(duì)S100A7在食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其可能機(jī)制進(jìn)行初步研究和探討，共分為3個(gè)部分。
　　第一部分、S100A7在食管鱗癌組織中的表達(dá)研究
　　方法:
　　1.采用Real Time-PCR及免疫組化技術(shù)驗(yàn)證S100A7 mRNA及其相應(yīng)的功能蛋白在食管鱗

6、癌組織、癌旁組織及正常食管組織的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探究臨床病理參數(shù)與二者表達(dá)水平之間的關(guān)系及其臨床意義。
　　2.采用Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)一步分析食管鱗癌患者生存預(yù)后與S100A7 mRNA及其蛋白表達(dá)情況的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.采用Real Time-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)食管鱗癌組織、癌旁組織及正常食管組織中均有S100A7 mRNA和蛋白的表達(dá)且表達(dá)水平呈依次下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

7、P＜0.05)。
　　2.S100A7 mRNA及其蛋白的表達(dá)與性別、腫瘤分化程度的高低及腫瘤體積的大小之間不存在相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；但與患者年齡、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移及TNM分期水平的高低相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線分析后發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者生存預(yù)后與S100A7 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。
　　第二部分、S100A7對(duì)食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移能力

8、的影響及其作用的分子機(jī)制
　　方法:
　　1.采用 RNAi技術(shù)使得食管鱗癌細(xì)胞系Eca-109中 S100A7表達(dá)下調(diào)，并利用Real Time-PCR及Western-blot檢測(cè)敲減后S100A7 mRNA及蛋白的表達(dá)量，利用CCK-8法及Boyden小室檢測(cè)S100A7表達(dá)水平下調(diào)對(duì)于食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　2.采用RNAi技術(shù)使S100A7表達(dá)下調(diào)，觀察S100A7表達(dá)下調(diào)

9、對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109表達(dá)E-cadheirn, vimentin和snail的影響。
　　結(jié)果:
　　1.S100A7 si-RNA能成功下調(diào)食管癌細(xì)胞Eca-109中S100A7 mRNA及蛋白的表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　2.食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109的增殖活性及其侵襲遷移能力在S100A7表達(dá)水平下調(diào)后受到明顯抑制且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.S100A7表達(dá)水平下調(diào)導(dǎo)致食

10、管鱗癌細(xì)胞株Eca-109的E-cadheirn表達(dá)量明顯上升，而vimentin和snail表達(dá)量顯著下降且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第三部分、S100A7 si-RNA對(duì)裸鼠體內(nèi)食管癌移植瘤的抑制作用
　　方法:
　　1.采用食管鱗癌細(xì)胞株 Eca-109進(jìn)行裸鼠移植瘤模型構(gòu)建，隨機(jī)分為3組并瘤旁注射等量的S100A7 si-RNA、對(duì)照si-RNA及PBS觀察對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響；
　　2.采

11、用Real time-PCR及免疫組化檢測(cè)瘤旁注射S100A7 si-RNA對(duì)移植瘤組織中S100A7、E-cadheirn、vimentin及snail表達(dá)水平的影響；
　　結(jié)果:
　　1.采用瘤旁注射S100A7 si-RNA能夠有效抑制移植瘤的生長(zhǎng)(P＜0.05)；
　　2.瘤旁注射S100A7 si-RNA能夠明顯抑制移植瘤組織中S100A7、vimentin及snail的表達(dá)水平，但能提高E-cadheirn

12、的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.S100A7 mRNA及其蛋白在食管鱗癌組織、癌旁組織及正常食管組織表達(dá)量呈現(xiàn)逐級(jí)遞減的趨勢(shì)，且在食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109中也有表達(dá)，表明S100A7與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為食管鱗癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子標(biāo)志。
　　2.通過(guò)RNAi技術(shù)可抑制食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109中S100A7表達(dá)水平，進(jìn)而抑制食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109增殖活性