玉米5-甲酰四氫葉酸環(huán)化連接酶基因的克隆及其在葉酸代謝調(diào)控中的功能研究.pdf

1、葉酸作為介導(dǎo)一碳代謝的重要輔因子，參與生物體內(nèi)的多種代謝活動(dòng)。5-甲酰四氫葉酸環(huán)化連接酶（5FCL）被報(bào)道催化貯存形式的5-甲酰四氫葉酸（5-CHO-THF）向代謝活性形式的葉酸轉(zhuǎn)化，本文對(duì)玉米中的5-甲酰四氫葉酸環(huán)化連接酶（5FCL）進(jìn)行了克隆和功能分析。通過(guò)體外酶活分析及在擬南芥中過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其蛋白功能，分析了玉米中Zm5FCL的表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位，并對(duì)玉米胚和胚乳中葉酸的分布及葉酸合成、代謝基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，取得的主

2、要研究結(jié)果如下：
　　1、基于擬南芥At5FCL的蛋白序列，我們從玉米中克隆了其同源蛋白(GI:GRMZM5G807835)，命名為Zm5FCL。與番茄和擬南芥5FCL蛋白序列比對(duì)，結(jié)果顯示序列相似度分別達(dá)到53.07％和52.38%，與人類、酵母、細(xì)菌的相似度分別達(dá)到22%-28%。Zm5FCL蛋白中包含5-formyltetrahydrofolate cycloligase結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其可能存在功能的保守性。
　　2、Z

3、m5FCL體外蛋白酶活測(cè)定及其在擬南芥5fcl突變體和野生型中的過(guò)表達(dá)分析結(jié)果顯示：體外酶活體系中Zm5FCL蛋白能夠?qū)?-CHO-THF轉(zhuǎn)化為5,10-次甲基四氫葉酸（5,10-CH=THF）；在5fcl突變體中過(guò)表達(dá) Zm5FCL后，突變體葉片中5-CHO-THF含量恢復(fù)到野生型水平，說(shuō)明Zm5FCL能夠互補(bǔ)At5FCL的功能；在野生型擬南芥中過(guò)表達(dá)Zm5FCL時(shí)，葉片中的5-CHO-THF顯著降低。
　　3、利用玉米原生質(zhì)體

4、瞬時(shí)表達(dá)分析顯示，初步判定Zm5FCL：：GFP融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。在玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中，Zm5FCL基因在胚中的表達(dá)量明顯高于胚乳。葉酸水平檢測(cè)分析顯示，5-甲基四氫葉酸（5-CH3-THF）含量在胚和胚乳之間存在存在顯著差異，胚中明顯高于胚乳，而胚和胚乳中的5-CHO-THF含量沒(méi)有明顯差異。
　　4、通過(guò)對(duì)胚和胚乳中葉酸合成及一碳代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ZmGTPCHI-2， ZmGDCH-1，ZmGDCT，