Slo3通道對小鼠精子Ca2+信號作用的研究.pdf

1、研究背景和目的:不育不孕癥是影響人類繁衍和心理健康的一種重要臨床疾病，其中約有一半的病因在于男性。精子是男性生育最重要的因素之一，由睪丸生成，它逐漸成熟后貯存在附睪內(nèi)，但此時的精子是不具有授精能力。精子進入雌性生殖道后，隨著理化環(huán)境（pH值、滲透壓和化學(xué)成份等）的改變，會經(jīng)歷獲能、超活化和頂體反應(yīng)等生理過程，最終完成授精。這些生理過程是精子功能必不可少的部分，對精子完成授精至關(guān)重要。
　　與在其它細胞相似，Ca2+作為精子細胞的第

2、二信使扮演著重要的角色，其直接或者間接調(diào)控精子獲能、超活化和頂體反應(yīng)等重要生理過程。Ca2+通過精子細胞膜上的Ca2+通道流入細胞中。目前利用電生理技術(shù)在小鼠精子上檢測到電流只有兩種，一是由CatSper通道介導(dǎo)的Ca2+電流;另一是由Slo3通道介導(dǎo)的K+電流。已經(jīng)有研究表明小鼠精子上最主要的K+離子通道——Slo3在精子的獲能過程中具有重要作用。隨著精子胞內(nèi)堿化，精子膜上的pH依賴的Slo3通道隨之開放，導(dǎo)致細胞膜電位超極化。膜電位

3、超極化可能通過兩方面影響精子Ca2+信號:一方面增加Ca2+內(nèi)流的驅(qū)動力使Ca2+內(nèi)流增多;另一方面降低電壓依賴的CatSper通道開放概率而減少Ca2+內(nèi)流。盡管推斷Slo3通道是精子Ca2+信號的重要調(diào)節(jié),但其單獨對的Ca2+信號作用尚不明確。在諸多的Slo1通道特異的以及廣泛的K+通道阻斷劑中，如CTX、 IbTX、TEA、4-AP以及奎尼丁等，只有奎尼丁能強效抑制Slo3通道。
　　另外活性氧物質(zhì)(Reactive oxy

4、gen species，ROS)對小鼠精子功能也具有影響作用。雖然適量的ROS與精子正常生理功能密切相關(guān)，但是ROS過量時會引起細胞氧化-抗氧化失衡，對精子造成嚴重的損傷，降低精子活性、抑制頂體反應(yīng)、嚴重影響精子的授精能力。ROS對精子造成的損傷與Slo3-/-精子的表型非常相似，另外已知ROS對Slo1通道有抑制作用，而Slo3與Slo1在結(jié)構(gòu)上非常相似，基于這些相似性我們推斷ROS可能通過作用于Slo3通道而對精子胞內(nèi)Ca2+信號有

5、影響作用。通過本課題的研究希望探索到男性不育與Slo3通道的相關(guān)病因，以及為開發(fā)新型、安全、有效的男性避孕藥提供理論依據(jù)。
　　方法:一、利用熒光共聚焦Ca2+成像技術(shù)，對三個月以上的雄鼠精子處理后進行實驗;對細胞進行以下處理:空白對照組（Ctrl）、奎尼丁處理組（Ctrl+Qui）、過氧化氫(H2O2)處理組，隨機選取三個月以上的雄性小鼠。實驗內(nèi)容:1、取小鼠附睪尾部分裝在離心管中離心;2、將離心后的精子分置在已經(jīng)涂有Cell-

6、Tak和Poly-L-lysine hydrobromide等試劑的容器中，并使細胞充分貼壁;3、在精子充分貼壁的容器中加入Fluo-4 AM染料，在保證室溫、避光等實驗條件下使細胞染色30分鐘;4、將黏貼有精子的容器充分清洗后，在60倍油鏡下觀察精子給藥后的熒光變化，激發(fā)光波長488 nm，接收波長535-565 nm。
　　二、利用膜片鉗技術(shù):在全細胞模式下充分研究奎尼丁對KSper的抑制，預(yù)期找到奎尼丁阻斷精子本身K+電流的

7、劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)果:1、奎尼丁會使精子細胞Ca2+信號降低，并且這種降低作用與奎尼丁濃度呈正相關(guān)，即隨著奎尼丁濃度的增加，其對精子Ca2+信號的抑制作用也增加?？岫嶒灊舛确謩e為0.1μM、1μM、10μM、100μM和1000μM，加藥后觀察到精子細胞Ca2+信號都下降，0.1μM濃度的奎尼丁可以引起精子內(nèi)Ca2+信號降低約16％;1μM濃度的奎尼丁可以引起精子內(nèi)Ca2+信號發(fā)生大約28％的下降;10μM濃度的奎尼丁就

8、可以引起精子內(nèi)Ca2+信號發(fā)生更大的變化，大約降低45％;而100μM及1000μM濃度的奎尼丁引起精子細胞Ca2+信號降低的幅度更大，分別約73％和90％。信號下降一般的藥物濃度(IC50)大約是11μM。有趣的是奎尼丁抑制KSper的IC50大約是10μM。
　　2、我們初步的數(shù)據(jù)表明H2O2也影響精子Ca2+信號。但與奎尼丁不同的是，過氧化氫在低濃度時表現(xiàn)出對精子Ca2+信號的促進作用;在高濃度時則表現(xiàn)出較大的抑制作用。過氧