富含亮氨酸的三角狀五肽重復結(jié)構(gòu)蛋白對自噬的調(diào)節(jié)及其機制的研究.pdf

1、腫瘤是是目前致死率最高的疾病之一，它是由非正常和不可控的一類細胞（腫瘤細胞）形成，隨著生長腫瘤會逐漸侵犯正常組織以及產(chǎn)生遠處轉(zhuǎn)移最終造成機體功能的損害。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的形成是一個復雜的過程，不僅受多種基因的調(diào)控，而且與機體內(nèi)許多生理功能如自噬、凋亡、應激等密切相關。近年來，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及術(shù)后預后過程中發(fā)揮的重要作用受到了高度的關注。自噬是指細胞降解受損細胞器如線粒體、核糖體或細胞內(nèi)長周期蛋白質(zhì)的一種重要生理過程，為維持細胞的穩(wěn)

2、定起著重要的作用。線粒體自噬是自噬的類型之一，可維持線粒體的穩(wěn)態(tài)。自噬在腫瘤中的作用與細胞所處的微環(huán)境有關，所處微環(huán)境不同自噬在腫瘤細胞中的作用可能完全相反：自噬的抑制不僅會造成細胞DNA穩(wěn)定性降低，而且可減少非正常細胞的死亡，從而促進腫瘤發(fā)生；腫瘤細胞所處環(huán)境發(fā)生變化時（缺乏營養(yǎng)、缺氧、能量不足等），自噬可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)細胞器及蛋白的降解速率來維持腫瘤細胞生存。
　　研究發(fā)現(xiàn)定位于線粒體內(nèi)膜的富含亮氨酸的三角狀五肽重復結(jié)構(gòu)蛋白（Le

3、ucine-rich pentatricopeptide repeat-containing protein，LRPPRC）在肺腺癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌以及淋巴瘤中高表達。它在腫瘤中表達情況與前列腺癌、胃癌、卵巢癌等腫瘤的分級、遠處轉(zhuǎn)移相關。更為重要的是，LRPPRC在腫瘤中表達越高，患者術(shù)后5年生存率以及10年生存率越低。除了與腫瘤的關系，LRPPRC與自噬也有著密切聯(lián)系。LRPPRC與自噬重要調(diào)節(jié)蛋白

4、MAP1S可以形成穩(wěn)定復合物，并且有學者認為LRPPRC可能參與到了自噬以及線粒體自噬的過程中。
　　本課題研究的目的是明確LRPPRC在自噬過程中發(fā)揮的基本生物功能，以及LRPPRC在自噬中的具體調(diào)節(jié)機制。實驗中使用HeLa、COS7、HEK-293T三種細胞系，研究LRPPRC蛋白水平的變化對自噬以及線粒體自噬水平的影響。并且著重分析了LRPPRC對維持線粒體穩(wěn)定所起的作用、LRPPRC對線粒體自噬調(diào)節(jié)通路PINK1/Park

5、in的影響以及LRPPRC在對自噬激活起關鍵調(diào)節(jié)作用的PI3K/Akt/mTOR信號通路中的效應。發(fā)現(xiàn)LRPPRC作為一種定位在線粒體內(nèi)膜上的蛋白，能參與自噬以及線粒體自噬調(diào)節(jié)過程，對維持機體和細胞穩(wěn)態(tài)起重要調(diào)節(jié)作用。這為以后研究LRPPRC在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及術(shù)后預后過程中所起作用的研究提供一定的實驗依據(jù)和理論基礎。
　　第1部分 LRPPRC對基礎自噬水平的影響
　　目的：探討LRPPRC表達水平被下調(diào)或上調(diào)后對基礎自噬水

6、平的影響。
　　方法：篩選并培養(yǎng)穩(wěn)定表達GFP-LC3的HeLa細胞（HeLa-GFP-LC3細胞）。在HeLa、HEK-293T和HeLa-GFP-LC3細胞中轉(zhuǎn)染LRPPRC siRAN抑制細胞LRPPRC表達含量，并在COS7細胞中轉(zhuǎn)染入GFP-LRPPRC質(zhì)粒使細胞內(nèi)LRPPRC過表達。應用電子顯微鏡掃描比較轉(zhuǎn)染LRPPRC siRAN與轉(zhuǎn)染Control siRAN的HeLa細胞中的自噬空泡。使用NH4Cl（20nM）或

7、者BAF（10nM）作為溶酶體抑制劑，抑制自噬小體降解。采用免疫印跡、免疫熒光方法檢測當細胞LRPPRC蛋白水平改變以及在有或無溶酶體抑制的條件各HeLa、HEK-293T和HeLa-GFP-LC3細胞中自噬標記物LC3、P62、GFP-LC3的表達量和COS7細胞中LC3的蛋白含量。
　　結(jié)果：HeLa、HEK-293T、HeLa-GFP-LC3細胞中LRPPRC水平下降均導致細胞內(nèi)LC3、P62、GFP-LC3蛋白水平降低，且

8、HeLa-GFP-LC3細胞中GFP-LC3熒光點減少。但是在加入溶酶體抑制劑后LRPPRC水平下降導致細胞內(nèi)LC3、P62、GFP-LC3升高明顯且高于LRPPRC表達正常的細胞，GFP-LC3熒光點聚集并呈斑塊狀也明顯多于LRPPRC表達正常的細胞。用電子透射顯微鏡觀察HeLa細胞中自噬相關結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)自噬空泡在抑制LRPPRC后下降，但是同時使用溶酶體抑制劑后明顯高于LRPPRC未被抑制的細胞。COS7細胞中LRPPRC蛋白水平的增

9、高使細胞內(nèi)LC3的表達含量增高，但加入溶酶體抑制劑后細胞中LC3的蛋白水平低于LRPPRC表達正常的細胞。
　　結(jié)論：LRPPRC被抑制細胞基礎自噬水平提高、LRPPRC過表達時基礎自噬水平降低。LRPPRC抑制時不僅能通過促進自噬小體的生成，而且可以促進自噬小體的降解速率。
　　第2部分LRPPRC對線粒體自噬的影響
　　目的：研究LRPPRC表達被抑制后細胞中線粒體以及線粒體自噬的改變情況。
　　方法：在He

10、La細胞中轉(zhuǎn)染LRPPRC siRAN抑制細胞LRPPRC表達含量。利用Mitotracker對細胞線粒體染色以及免疫熒光對cytochrome c染色的方法比較正常細胞與LRPPRC表達抑制HeLa細胞中線粒體電位情況。使用Tom20標記線粒體，并采用免疫熒光、免疫印跡方法比較有或無溶酶體處理的正常HeLa細胞、LRPPRC表達抑制HeLa細胞中線粒體總量。還應用免疫熒光雙染色法對比研究有或無溶酶體處理的HeLa-GFP-LC3細胞、

11、LRPPRC表達抑制的HeLa-GFP-LC3細胞中，Tom20標記的線粒體與LAMP1/2標記的溶酶體或LC3標記的自噬小體的共定位情況。
　　結(jié)果：LRPPRC被抑制表達后，HeLa細胞內(nèi) Mitotracker熒光減弱、cytochrome c熒光與免疫印跡檢測的蛋白含量均下降。未使用溶酶體抑制劑時，LRPPRC抑制細胞中Tom20標記的線粒體與GFP-LC3的共定位、Tom20的總量都比正常細胞少。在使用了溶酶體抑制劑后，

12、LRPPRC被抑制細胞中Tom20標記的線粒體與GFP-LC3的共定位比LRPPRC未被抑制的細胞多，且兩種細胞中Tom20的總量相同。在使用了溶酶體抑制劑后，LRPPRC被抑制細胞中Tom20標記的線粒體與LAMP1/2標記的溶酶體或LC3標記的自噬小體的共定位均多于LRPPRC未被抑制的細胞。
　　結(jié)論：LRPPRC可以維持線粒體電位穩(wěn)定，并且抑制LRPPRC的表達導致線粒體自噬的激活。
　　第3部分LRPPRC在線粒體

13、自噬中調(diào)節(jié)機制的研究
　　目的：研究LRPPRC在線粒體自噬過程中發(fā)揮的作用，以及LRPPRC與線粒體自噬調(diào)節(jié)信號通路PINK1/Parkin間的相互關系。
　　方法：采用CCCP（10μM）或6-OHDA（100μM）處理細胞，建立線粒體自噬的細胞模型。HEK-293T細胞在CCCP或6-OHDA處理后，應用免疫印跡方法檢測不同時間點有或無溶酶體抑制劑處理的細胞中自噬相關蛋白ATG5-12、LC3、Bcl-2、P27以及L

14、RPPRC的蛋白水平，并通過電子顯微鏡觀測這些細胞中線粒體的形態(tài)與數(shù)量。利用免疫共沉淀方法對比檢測HEK-293T細胞有或無CCCP處理時細胞中內(nèi)源性LRPPRC與內(nèi)源性Parkin的相互關系。并且在HeLa細胞中轉(zhuǎn)染GFP-Parkin質(zhì)粒后，通過免疫熒光雙染法與免疫共沉淀方法對比檢測有或無CCCP處理的細胞中內(nèi)源性LRPPRC與外源性GFP-Parkin的相互關系。在HeLa細胞中過表達RFP-LC3，并篩選穩(wěn)定表達（HeLa-RF

15、P-LC3）細胞株。為了明確LRPPRC在線粒體自噬中的作用使用CCCP處理轉(zhuǎn)染GFP-Parkin質(zhì)粒的HeLa-RFP-LC3細胞，采用免疫熒光方法觀察不同時間點時細胞內(nèi)GFP-Parkin、LRPPRC、RFP-LC3、LAMP2標記的溶酶體、Tom20標記的線粒體之間的共定位現(xiàn)象。在HEK-293T細胞中轉(zhuǎn)染Parkin siRNA或HeLa細胞Parkin-GFP質(zhì)粒，以及在GFP-Parkin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細胞中使用CC

16、CP處理不同時間，用免疫印跡的方法比較HEK-293T細胞、HeLa細胞中Parkin蛋白水平的變化對LRPPRC的影響以及比較表達Parkin-GFP與GFP的HeLa細胞中CCCP處理不同時間后Tom20、LRPPRC蛋白水平的變化。在HeLa細胞中采用轉(zhuǎn)染LRPPRC siRNA，或在COS7細胞中轉(zhuǎn)染GFP-LRPPRC質(zhì)粒，達到調(diào)節(jié)細胞中LRPPRC的水平。在過表達GFP-LRPPRC和GFP的細胞（對照細胞）內(nèi)加入蛋白合成抑

17、制劑CHX，以及在CHX處理不同時間后這兩種細胞中Parkin蛋白的變化。同樣，使用免疫印跡比較細胞中LRPPRC蛋白水平的變化后在有或無 CCCP處理的細胞中線粒體蛋白 VDAC1、MFN-1、Drp1和Tom20、Parkin蛋白的蛋白含量，并采用免疫熒光的方法觀察轉(zhuǎn)染LRPPRC-GFP質(zhì)?；騁FP質(zhì)粒的COS7細胞在CCCP處理不同時間點線粒體形態(tài)的變化。
　　結(jié)果：CCCP或6-OHDA處理HEK-293T細胞后，LRP

18、PRC均在藥物作用較長時間24h或12h才開始逐漸降低，Tom20蛋白水平的降低落后于LRPPRC。在CCCP或6-OHDA處理前期ATG5-12、LC3蛋白表達增高，并在加入溶酶體抑制劑后有累積，但在較長時間24h或12h后，ATG5-12、LC3蛋白表達含量在同時加入溶酶體抑制劑后仍不能夠增高。細胞中Bcl-2、P27隨著藥物使用時間延長蛋白水平均下降。電鏡下觀察HEK-293T細胞在6h時細胞內(nèi)腫脹細胞增多，48h后即使加入溶酶體

19、抑制劑細胞內(nèi)仍不能發(fā)現(xiàn)完整線粒體。免疫共沉淀實驗顯示HEK-293T細胞中內(nèi)源性Parkin與LRPPRC，以及過表達GFP-Parkin質(zhì)粒的HeLa細胞中外源性Parkin與LRPPRC之間均存在相互結(jié)合現(xiàn)象，并且在CCCP處理2.5h后，Parkin與LRPPRC的結(jié)合率在兩種細胞中均增高。HeLa-RFP-LC3細胞轉(zhuǎn)染GFP-Parkin及GFP質(zhì)粒后用在CCCP處理不同時間，在12h時Tom20、Parkin標記的線粒體才開

20、始與LC3標記的自噬小體、LAMP2標記的溶酶體有共定位，而這些與LC3、LAMP2結(jié)合的線粒體均是有LRPPRC缺失。HEK-293T細胞中Parkin的蛋白水平變化對LRPPRC沒有影響，HeLa細胞中過表達GFP-Parkin也不影響LRPPRC的蛋白水平。但HeLa細胞中過表達GFP-Parkin使細胞在CCCP的處理下LRPPRC和Tom20蛋白降低速度加快。HEK-293T細胞中LRPPRC被抑制后Parkin蛋白水平下降并

21、且過表達GFP-LRPPRC可以延長COS7細胞中Parkin蛋白半衰期。在有或無使用CCCP處理的條件下LRPPRC降低后均可以促進HEK-293T細胞中Parkin底物VDAC1、MFN-1、Drp1和Tom20蛋白水平降低速度。LRPPRC-GFP過表達的COS7比僅過表達GFP的COS7細胞的Parkin以及Tom20降低速度明顯減慢，且免疫熒光顯示GFP-LRPPRC表達的COS7細胞中線粒體熒光持續(xù)時間比僅表達GFP的細胞長

22、。
　　結(jié)論：LRPPRC可以與Parkin相互結(jié)合，并且在線粒體自噬中Parkin從細胞胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體上后與LRPPRC結(jié)合，使得LRPPRC與Parkin結(jié)合增多并啟動線粒體上相關蛋白通過溶酶體途徑降解。LRPPRC可以維持Parkin的穩(wěn)定性，并且抑制線粒體通過自噬降解。
　　第4部分 LRPPRC對自噬起始信號通路PI3K/Akt/mTOR的調(diào)節(jié)作用的研究
　　目的：明確LRPPRC與Bcl-2、Beclin

23、1、PI3KCIII之間的相互關系，以及LRPPRC在PI3K/Akt/mTOR通路激活過程中的作用。
　　方法：在HEK-293T細胞中轉(zhuǎn)染GFP-Parkin和/或轉(zhuǎn)染LRPPRC siRNA后，用免疫印跡方法檢測細胞內(nèi)Bcl-2、LC3的蛋白水平。使用免疫印跡方法檢測轉(zhuǎn)入LRPPRC siRNA和/或P27 siRNA、LRPPRC siRNA和/或ATG5 siRNA以及三種 siRNA共同轉(zhuǎn)染的HeLa細胞在有或無使用溶

24、酶體抑制時，LRPPRC、ATG5、P27和LC3的蛋白水平變化。采用免疫印跡方法比較轉(zhuǎn)染LRPPRC siRNA和Control siRNA的HeLa細胞與HEK-293T細胞以及LRPPRC表達高的COS7細胞中Bcl-2、Beclin1、PI3KCIII的蛋白含量。使用免疫共沉淀方法比較 LRPPRC抑制的HeLa細胞與 HEK-293T細胞中Bcl-2、Beclin1、PI3KCIII三種蛋白相互結(jié)合情況。
　　結(jié)果：LR

25、PPRC表達受抑制時細胞中Bcl-2、LC3蛋白水平均降低，同時過表達Parkin會使原本減低的Bcl-2、LC3蛋白水平有一定程度增高。LRPPRC抑制并加入溶酶體抑制時LC3增多，對細胞中ATG5、P27的蛋白水平無影響。加入溶酶體抑制后，抑制ATG5表達，LC3降低。同時抑制LRPPRC和ATG5的表達后，細胞中LC3也減低。同時抑制LRPPRC、ATG5、P27的表達后，細胞中LC3也減低明顯。HeLa細胞與HEK-293T細胞

26、LRPPRC表達抑制后相對于LRPPRC表達正常的細胞，僅有Bcl-2蛋白含量降低，Beclin1、PI3KCIII的蛋白含量不變。COS7細胞LRPPRC表達增高后，也僅有Bcl-2蛋白含量降低，Beclin1、PI3KCIII的蛋白含量不變。HeLa細胞與HEK-293T細胞中，LRPPRC與Bcl-2、Beclin1結(jié)合，不與PI3KCIII結(jié)合，并且當LRPPRC被抑制后，LRPPRC Bcl-2、Beclin1結(jié)合下降，Bcl