自噬相關(guān)線粒體蛋白mitofilin的鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、目的：
　　 1、建立饑餓誘導的HeLa細胞自噬模型以及相應(yīng)的檢測指標體系,并以蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選自噬后發(fā)生表達變化的線粒體蛋白質(zhì)。
　　 2、對篩選出的其中一個差異線粒體蛋白質(zhì)mitofilin進一步進行驗證,以確認其在自噬前后的差異表達。
　　 3、探索mitofilin與自噬的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1、HeLa細胞傳代培養(yǎng),采用饑餓法(以HBSS代替培養(yǎng)基)誘導HeLa細胞產(chǎn)生自噬。<

2、br>　　 2、HeLa細胞自噬檢測:透射電鏡檢測自噬體的雙層或多層膜結(jié)構(gòu)形成；Westernblot檢測正常HeLa細胞與自噬細胞的自噬體標記蛋白LC3。
　　 3、HeLa細胞傳代培養(yǎng),至細胞總量達到約1×108個左右時,采用饑餓法(以HBSS代替培養(yǎng)基)誘導HeLa細胞產(chǎn)生自噬,用試劑盒提取正常組與自噬組HeLa細胞線粒體蛋白。
　　 4、采用雙向電泳(pH3-10)建立自噬狀態(tài)下與正常狀態(tài)下的線粒體差異蛋白質(zhì)圖

3、譜。
　　 5、利用PDQuest對雙向圖譜進行分析,篩選出差異蛋白。
　　 6、采用LC/MS/MS質(zhì)譜鑒定上述篩選到的差異蛋白并以Mascot等蛋白質(zhì)搜索引擎檢索Swissprot、NCBInr等數(shù)據(jù)庫,獲得蛋白質(zhì)信息。
　　 7、Western blot與Real-time PCR驗證差異蛋白之一mitofilin在自噬前后的差異表達。
　　 8、克隆mitofilin基因,將其插入pcDNA3.1

4、(+)-HA質(zhì)粒構(gòu)建真核表達載體,并合成其siRNA片段。
　　 9、構(gòu)建將自噬體特異標記蛋白LC3基因克隆至真核表達載體pEGFP-C1并轉(zhuǎn)染HeLa細胞,建立GFP-LC3/HeLa穩(wěn)定細胞株,以便于對自噬相關(guān)蛋白的功能進行研究。
　　 10、采用RNAi和過表達技術(shù),結(jié)合饑餓誘導模型與自噬檢測體系,檢測mitofilin高表達/表達受阻的情況下是否誘導/抑制細胞自噬,從而研究其在自噬發(fā)生過程中的作用。
　　

5、 結(jié)果：
　　 1、建立饑餓法誘導HeLa細胞產(chǎn)生自噬的模型及其檢測體系,并摸索確定了線粒體提純方法。
　　 2、篩選得到了自噬狀態(tài)下與正常狀態(tài)下的部分差異線粒體蛋白質(zhì)。
　　 3、Western blot與Real-time PCR驗證mitofilin在細胞發(fā)生自噬時在mRNA水平與蛋白水平均下調(diào)。
　　 4、建立了穩(wěn)定表達GFP-LC3的HeLa細胞株,為自噬相關(guān)蛋白質(zhì)的功能研究提供了有利的實驗模型