乙肝病毒X蛋白通過(guò)長(zhǎng)非編碼RNA HULC促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞肝癌(HCC)的發(fā)生的重要原因，乙肝病毒X蛋白(HBx)在HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。HBx蛋白對(duì)于HBV本身復(fù)制具有重要作用，具有反式激活功能，通過(guò)與多個(gè)癌基因相互作用和參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)影響細(xì)胞周期，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖，同時(shí)也能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合直接調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。長(zhǎng)非編碼RNA(Longnon coding RNA，LncRNA)可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)

2、靶基因表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和死亡等過(guò)程。LncRNA可通過(guò)干擾轉(zhuǎn)錄、引起染色體重塑、組蛋白修飾、改變蛋白質(zhì)定位和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性等調(diào)節(jié)作用發(fā)揮功能。LncRNAHULC(highly7up-regulated in liver cancer，HULC)是一種在肝癌中高表達(dá)的長(zhǎng)非編碼RNA，但其在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用迄今不清。為了進(jìn)一步闡明長(zhǎng)非編碼RNA HULC是否參與HBx致癌的過(guò)程，本文探討了LncRNAHULC在

3、HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用及其分子機(jī)制。主要內(nèi)容如下：
　　 第一部分：HBx上調(diào)HULC的作用及其分子機(jī)制首先，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)了21例臨床肝癌組織和其癌旁組織中HULC的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與癌旁相比HULC在肝癌組織中高表達(dá)。在33例肝癌標(biāo)本(包括上述21例肝癌組織)中發(fā)現(xiàn)HBx mRNA的表達(dá)水平與HULC的表達(dá)水平呈正相關(guān)。Real-time PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比HULC在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx的肝

4、細(xì)胞L-O2-X和肝癌HepG2-X細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)RNA干擾HBxmRNA，可下調(diào)HULC的表達(dá)，呈劑量依賴性；在人永生化肝細(xì)胞L-O2中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx，HULC的表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)，呈劑量依賴性。為了進(jìn)一步研究HBx上調(diào)HULC的分子機(jī)制，首先克隆了HULC的啟動(dòng)子核心區(qū)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在L-O2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HBx可激活HULC啟動(dòng)子的活性，呈劑量依賴性，而在HepG2-X細(xì)胞中干擾HBx mRNA后HULC的表達(dá)水

5、平發(fā)生下調(diào)，呈劑量依賴性。HULC啟動(dòng)子區(qū)含有cAMP response element-binding(CREB)結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)干擾CREB mRNA或?qū)ULC啟動(dòng)子的CREB結(jié)合位點(diǎn)突變，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-O2-X和HepG2-X細(xì)胞中HULC的啟動(dòng)子活性明顯下降。應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，HBx可通過(guò)直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CREB上調(diào)HULC的表達(dá)。
　　 第二部分：LncRNA HULC促進(jìn)肝癌細(xì)胞

6、增殖的作用HULC對(duì)肝癌細(xì)胞調(diào)節(jié)的功能不清。為了探討HBx是否通過(guò)HULC促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，應(yīng)用MTT方法檢測(cè)了瞬時(shí)過(guò)表達(dá)HULC對(duì)L-O2肝細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HULC可明顯促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，呈時(shí)間依賴性；反之，在L-O2-X和HepG2-X中干擾HULC則可抑制上述細(xì)胞的生長(zhǎng)，呈時(shí)間依賴性。EdU檢測(cè)顯示，在HepG2-X細(xì)胞中干擾HuLC可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖；克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，在HepG2-X細(xì)胞中干擾HULC可明

7、顯降低細(xì)胞的克隆形成能力；裸鼠動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HepG2-X細(xì)胞中干擾HULC可顯著降低肝癌細(xì)胞的成瘤能力，進(jìn)一步應(yīng)用Realtime PCR檢測(cè)，與對(duì)照組相比在移植瘤組織中HULC的水平明顯降低。因此，LncRNA HULC具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用。
　　 第三部分：LncRNA HULC促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖分子機(jī)制的研究為了進(jìn)一步研究LncRNA HULC促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，通過(guò)檢索HULC基因所在的6p24.

8、3區(qū)域的編碼基因，發(fā)現(xiàn)HULC基因附近存在SLC3583和抑癌基因p18兩個(gè)編碼基因。文獻(xiàn)報(bào)道，HULC對(duì)SLC3583調(diào)節(jié)作用并不明顯，因此我們探討了HULC對(duì)p18的調(diào)控作用。我們首先檢測(cè)了上述21例肝癌組織和癌旁組織中p18的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)p18在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，并且在上述33例肝癌組織中發(fā)現(xiàn)p18的表達(dá)水平與HULC的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。在HepG2細(xì)胞中干擾HULC，顯示p18的mRNA水平和蛋白水平發(fā)生上

9、調(diào)，呈劑量依賴性。將p18基因(-1003到+349nt)克隆到pGL3-Basic載體上，報(bào)告基因結(jié)果顯示，該區(qū)域具有啟動(dòng)子活性。報(bào)告基因顯示，在肝細(xì)胞L-O2中過(guò)表達(dá)HULC可抑制p18的啟動(dòng)子活性，呈劑量依賴性；當(dāng)干擾HepG2細(xì)胞中HULC，可激活p18的啟動(dòng)子活性，呈劑量依賴性。上述結(jié)果表明，HULC通過(guò)抑制p18基因的啟動(dòng)子活性進(jìn)而抑制p18的表達(dá)。MTT分析結(jié)果顯示，雙干擾p18和HULC，發(fā)現(xiàn)干擾HULC可以降低干擾p1

10、8促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力。檢測(cè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤組織中p18的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在si-HULC組的移植瘤組織中p18蛋白的表達(dá)水平明顯高于si-Ctrl組，進(jìn)一步證實(shí)了si-HULC抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用與上調(diào)p18有關(guān)。
　　 第四部分：HULC和p18在HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖中的作用為了探討HULC和p18在HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖中的作用，對(duì)L-O2/L-O2-X(HepG/HepG2-X)中p18的蛋白水平進(jìn)行了比較。免疫印跡結(jié)果

11、顯示，與L-O2或HepG2相比，L-O2-X或HepG2-X細(xì)胞中p18蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)；反之，在L-O2-X或HepG2-X細(xì)胞中干擾HBx mRNA可導(dǎo)致p18的表達(dá)水平上調(diào)，表明HBx具有下調(diào)p18的作用。進(jìn)一步在L-O2-X或HepG2-X細(xì)胞中干擾HULC，發(fā)現(xiàn)si-HULC可上調(diào)p18的表達(dá)水平，提示HBx通過(guò)上調(diào)HULC進(jìn)而下調(diào)p18的表達(dá)。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，si-HULC可阻斷HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的能力，而且