乙肝病毒X蛋白通過長非編碼RNA HULC促進肝癌細胞增殖的作用及分子機制研究.pdf

1、乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是導致肝細胞肝癌(HCC)的發(fā)生的重要原因，乙肝病毒X蛋白(HBx)在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。HBx蛋白對于HBV本身復制具有重要作用，具有反式激活功能，通過與多個癌基因相互作用和參與細胞信號轉導通路來影響細胞周期，進而影響細胞的增殖，同時也能與轉錄因子結合直接調控下游基因的轉錄。長非編碼RNA(Longnon coding RNA，LncRNA)可通過多種途徑調節(jié)

2、靶基因表達，參與調控細胞的生長、發(fā)育、衰老和死亡等過程。LncRNA可通過干擾轉錄、引起染色體重塑、組蛋白修飾、改變蛋白質定位和調節(jié)蛋白質活性等調節(jié)作用發(fā)揮功能。LncRNAHULC(highly7up-regulated in liver cancer，HULC)是一種在肝癌中高表達的長非編碼RNA，但其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用迄今不清。為了進一步闡明長非編碼RNA HULC是否參與HBx致癌的過程，本文探討了LncRNAHULC在

3、HBx促進肝癌細胞增殖的作用及其分子機制。主要內容如下：
　　 第一部分：HBx上調HULC的作用及其分子機制首先，通過Real-time PCR檢測了21例臨床肝癌組織和其癌旁組織中HULC的表達水平。結果顯示，與癌旁相比HULC在肝癌組織中高表達。在33例肝癌標本(包括上述21例肝癌組織)中發(fā)現(xiàn)HBx mRNA的表達水平與HULC的表達水平呈正相關。Real-time PCR結果顯示，與對照組相比HULC在穩(wěn)定轉染HBx的肝

4、細胞L-O2-X和肝癌HepG2-X細胞中表達上調，通過RNA干擾HBxmRNA，可下調HULC的表達，呈劑量依賴性；在人永生化肝細胞L-O2中瞬時轉染HBx，HULC的表達水平發(fā)生上調，呈劑量依賴性。為了進一步研究HBx上調HULC的分子機制，首先克隆了HULC的啟動子核心區(qū)，雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，在L-O2細胞中過表達HBx可激活HULC啟動子的活性，呈劑量依賴性，而在HepG2-X細胞中干擾HBx mRNA后HULC的表達水

5、平發(fā)生下調，呈劑量依賴性。HULC啟動子區(qū)含有cAMP response element-binding(CREB)結合位點。當干擾CREB mRNA或將HULC啟動子的CREB結合位點突變，應用雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，L-O2-X和HepG2-X細胞中HULC的啟動子活性明顯下降。應用染色質免疫共沉淀實驗進一步證實，HBx可通過直接結合轉錄因子CREB上調HULC的表達。
　　 第二部分：LncRNA HULC促進肝癌細胞

6、增殖的作用HULC對肝癌細胞調節(jié)的功能不清。為了探討HBx是否通過HULC促進肝癌的發(fā)生發(fā)展，應用MTT方法檢測了瞬時過表達HULC對L-O2肝細胞增殖的影響。結果顯示，過表達HULC可明顯促進肝細胞增殖，呈時間依賴性；反之，在L-O2-X和HepG2-X中干擾HULC則可抑制上述細胞的生長，呈時間依賴性。EdU檢測顯示，在HepG2-X細胞中干擾HuLC可顯著抑制肝癌細胞的增殖；克隆形成實驗顯示，在HepG2-X細胞中干擾HULC可明

7、顯降低細胞的克隆形成能力；裸鼠動物成瘤實驗結果顯示，在HepG2-X細胞中干擾HULC可顯著降低肝癌細胞的成瘤能力，進一步應用Realtime PCR檢測，與對照組相比在移植瘤組織中HULC的水平明顯降低。因此，LncRNA HULC具有促進肝癌細胞增殖的作用。
　　 第三部分：LncRNA HULC促進肝癌細胞增殖分子機制的研究為了進一步研究LncRNA HULC促進肝癌細胞增殖的分子機制，通過檢索HULC基因所在的6p24.

8、3區(qū)域的編碼基因，發(fā)現(xiàn)HULC基因附近存在SLC3583和抑癌基因p18兩個編碼基因。文獻報道，HULC對SLC3583調節(jié)作用并不明顯，因此我們探討了HULC對p18的調控作用。我們首先檢測了上述21例肝癌組織和癌旁組織中p18的表達水平，發(fā)現(xiàn)p18在肝癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織，并且在上述33例肝癌組織中發(fā)現(xiàn)p18的表達水平與HULC的表達水平呈負相關。在HepG2細胞中干擾HULC，顯示p18的mRNA水平和蛋白水平發(fā)生上

9、調，呈劑量依賴性。將p18基因(-1003到+349nt)克隆到pGL3-Basic載體上，報告基因結果顯示，該區(qū)域具有啟動子活性。報告基因顯示，在肝細胞L-O2中過表達HULC可抑制p18的啟動子活性，呈劑量依賴性；當干擾HepG2細胞中HULC，可激活p18的啟動子活性，呈劑量依賴性。上述結果表明，HULC通過抑制p18基因的啟動子活性進而抑制p18的表達。MTT分析結果顯示，雙干擾p18和HULC，發(fā)現(xiàn)干擾HULC可以降低干擾p1

10、8促進細胞增殖的能力。檢測動物實驗腫瘤組織中p18的表達水平，結果顯示在si-HULC組的移植瘤組織中p18蛋白的表達水平明顯高于si-Ctrl組，進一步證實了si-HULC抑制肝癌細胞增殖的作用與上調p18有關。
　　 第四部分：HULC和p18在HBx促進肝癌細胞增殖中的作用為了探討HULC和p18在HBx促進肝癌細胞增殖中的作用，對L-O2/L-O2-X(HepG/HepG2-X)中p18的蛋白水平進行了比較。免疫印跡結果

11、顯示，與L-O2或HepG2相比，L-O2-X或HepG2-X細胞中p18蛋白的表達水平明顯下調；反之，在L-O2-X或HepG2-X細胞中干擾HBx mRNA可導致p18的表達水平上調，表明HBx具有下調p18的作用。進一步在L-O2-X或HepG2-X細胞中干擾HULC，發(fā)現(xiàn)si-HULC可上調p18的表達水平，提示HBx通過上調HULC進而下調p18的表達。MTT檢測結果顯示，si-HULC可阻斷HBx促進肝癌細胞增殖的能力，而且