CaveoliN-1通過Wnt-β-Catenin信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥因子對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用.pdf

1、背景：
　　椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration，IVDD)引起的慢性腰痛(low backpain，LBP)是中老年人群最為常見的病癥之一。每年與慢性腰痛相關(guān)的醫(yī)療費(fèi)用及社會(huì)、經(jīng)濟(jì)投入巨大，并且隨著老齡化社會(huì)的到來，這些支出和投入還將繼續(xù)增加。目前針對(duì)于IVDD的病理機(jī)制研究非常廣泛，研究顯示年齡、基因、營養(yǎng)、代謝、感染、生物力學(xué)等諸多因素都其發(fā)病相關(guān)。然而，IVDD的確切病因仍不甚明了。

2、
　　椎間盤退變性疾病是椎間盤退變過程進(jìn)展及惡化的必然結(jié)果。在IVDD的過程中，髓核細(xì)胞因凋亡出現(xiàn)數(shù)量減少、表型異常。有研究指出髓核細(xì)胞的凋亡是IVDD的啟動(dòng)因素之一。另外，包括IL-1β和TNF-α在內(nèi)的炎癥因子在退變的椎間盤內(nèi)有顯著的升高。通過一系列信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，炎癥因子可以導(dǎo)致髓核細(xì)胞的凋亡、加速IVDD的進(jìn)程。然而，髓核細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前仍需進(jìn)一步的探索。
　　許多基因在IVDD過程中發(fā)揮了重要的作用，包括Caveoli

3、n-1（又稱小窩蛋白-1、窖蛋白-1）。細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷形成囊狀結(jié)構(gòu)脂筏(Caveolea)，Caveolin-1是其標(biāo)志蛋白，可表達(dá)于多種組織，對(duì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、胞膜運(yùn)輸和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路等都具有調(diào)節(jié)作用。Heathfield等的研究首次證實(shí)Caveolin-1在人類髓核細(xì)胞的表達(dá)。最期研究顯示Caveolin-1是IVDD的關(guān)鍵因素之一。退變椎間盤的髓核細(xì)胞高水平表達(dá)Caveolin-1，與細(xì)胞的壞死有相關(guān)性。另外，在支氣管表皮細(xì)胞、血管

4、平滑肌細(xì)胞以及人白血病細(xì)胞系HL-60的研究中已經(jīng)證實(shí)了Caveolin-1對(duì)于細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。然而，關(guān)于Caveolin-1與髓核細(xì)胞凋亡的研究目前仍很有限。
　　在軟骨細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的研究中，Caveolin-1能夠通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控其下游的基因表達(dá)。在IVDD的早期，Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性升高。相關(guān)研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路在IVDD進(jìn)程發(fā)揮了重要作用。那

5、么，Caveolin-1是否可以通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路在IVDD進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用？本研究將對(duì)Caveolin-1在IVDD中的作用做出進(jìn)一步的研究，對(duì)Caveolin-1和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在髓核細(xì)胞凋亡中的相互聯(lián)系進(jìn)行分析探討。
　　目的：
　　1.研究Caveolin-1在髓核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，在炎癥誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡過程中的作用。
　　2.Wnt/β-catenin信號(hào)

6、通路在炎癥誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮的作用。
　　3.Caveolin-1和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在炎癥誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡過程中的相互作用聯(lián)系及作用機(jī)制。
　　方法：
　　為研究炎癥因子對(duì)Caveolin-1在髓核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的作用，培養(yǎng)的髓核細(xì)胞分別進(jìn)行IL-1β(10ng/ml)或TNF-α(50ng/ml)的處理。經(jīng)過0、1、6、12、24、48小時(shí)后，分別應(yīng)用Western blotting和Rea

7、l time RT-PCR技術(shù)對(duì)髓核細(xì)胞內(nèi)Caveolin-1的蛋白水平和mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　為研究Caveolin-1對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的作用，培養(yǎng)的髓核細(xì)胞進(jìn)行炎癥因子的處理，應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)髓核細(xì)胞內(nèi)Caveolin-1的表達(dá)。FITC-AnnexinV/PI熒光染色各處理組的髓核細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)分別對(duì)各個(gè)處理組的凋亡率進(jìn)行量化檢測(cè)。
　　為研究炎癥因子對(duì)髓核細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用，

8、培養(yǎng)的髓核細(xì)胞如上述實(shí)驗(yàn)步驟分別進(jìn)行IL-1β(10ng/ml)或TNF-α(50ng/ml)的處理。經(jīng)過0、6、12、24小時(shí)后，分別應(yīng)用Westem blotting和Real time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)髓核細(xì)胞內(nèi)β-catenin的蛋白水平和mRNA水平表達(dá)情況。
　　為研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的作用，應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)髓核細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)，采用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)髓核細(xì)胞的凋

9、亡率。
　　為研究Caveolin-1和WNT/β-catenin信號(hào)通路在髓核細(xì)胞凋亡過程中的相互作用，我們分別進(jìn)行了髓核細(xì)胞的Caveolin-1沉默和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。分別應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和檢測(cè)Caspase-3，8，9活性變化的方法評(píng)估髓核細(xì)胞的凋亡情況。并且通過β-cateninsi RNA抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路后，檢測(cè)對(duì)Caveolin-1的作用的影響。
　　結(jié)果：
　　1.炎癥因子促進(jìn)髓核細(xì)胞內(nèi)C

10、aveolin-1的表達(dá)
　　髓核細(xì)胞經(jīng)炎癥因子處理后，Caveolin-1在蛋白水平和mRNA的表達(dá)水平都出現(xiàn)了明顯的上升。其中髓核細(xì)胞內(nèi)Caveolin-1的mRNA的表達(dá)在炎癥因子處理12小時(shí)后達(dá)到高峰，為基線值的4.0倍（IL-1β處理組）和3.3倍（TNF-α處理組）。
　　2.Caveolin-1對(duì)炎癥誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用
　　經(jīng)過炎癥因子的處理以后，髓核細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)了顯著的升高，從5.2％（對(duì)照

11、組）分別上升到29.3％（IL-1β處理組）和26.2％（TNF-α處理組）。髓核細(xì)胞凋亡率的升高能夠被Caveolin-1siRNA抑制。經(jīng)過Caveolin-1 siRNA處理以后髓核細(xì)胞的凋亡率分別下降到了16％(IL-1β+Caveolin-1siRNA處理組)和14.9％(TNF-α+ Caveolin-1siRNA處理組)。
　　3.炎癥因子誘導(dǎo)Wnt/β-catenin通路的激活
　　經(jīng)炎癥因子的處理后，髓核細(xì)

12、胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)明顯升高。其中β-cateninmRNA的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間依賴的方式升高，24小時(shí)以后分別達(dá)到基線水平的3.47倍（IL-1β處理組）和2.81倍（TNF-α處理組）。經(jīng)過炎癥因子的處理后TOP Flash轉(zhuǎn)錄活性明顯升高，F(xiàn)OP Flash的轉(zhuǎn)錄活性無改變。
　　4.Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的作用
　　β-catenin siRNA組，β-catenin的核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與IL-1β

13、處理組和TNF-α處理組相比較有明顯的下降。經(jīng)過炎癥因子的處理，髓核細(xì)胞凋亡率明顯升高。髓核細(xì)胞凋亡率的升高能夠被β-catenin siRNA逆轉(zhuǎn)，凋亡率分別下降到13.8％(IL-1β+β-catenin siRNA處理組)和11.2％(TNF-α+β-catenin siRNA處理組)。
　　5.Caveolin-1和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在炎癥誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡過程中的相互作用
　　經(jīng)過炎癥因子的處理后髓

14、核細(xì)胞內(nèi)β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的增加能夠被Caveolin-1siRNA所抑制。炎癥因子處理后髓核細(xì)胞Caspase-3，9的活性明顯升高，Caveolin-1siRNA和β-catenin siRNA均能抑制該效應(yīng)。Caveolin-1過表達(dá)處理后，β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)增加，Caspase-3，9的活性出現(xiàn)明顯的升高，然而該效應(yīng)在β-catenin siRNA處理組被抑制。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果表明，在