一步反轉錄FRET-qPCR檢測甲型流感病毒方法的建立及應用.pdf

1、流感病毒基于其核蛋白抗原的多樣性，分為甲(A)型、乙(B)型、丙(C)型，其中甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)具有廣泛的宿主譜;抗原漂移和抗原轉換導致新IAV血清亞型和變異株不斷出現(xiàn)，甚至產(chǎn)生高致病性強毒株，并且可能跨越物種障礙進而感染人類，造成局部地區(qū)乃至世界范圍流感疫情的暴發(fā)。因此，IAV不同血清亞型和變異株的快速檢測對甲型流感的防控具有重要意義。目前IAV檢測方法主要有病原學、血清學和分子生物學診斷技術。

2、其中病原學方法耗時費力;血清學方法特異性較低，容易出現(xiàn)交叉反應;分子生物學診斷技術敏感性和特異性較強，但多為兩步法，且不能同時檢測多個IAV血清亞型。因此，本研究主要是建立一種快速靈敏，可檢測所有常見IAV血清亞型的方法，并且成功地應用于我國活禽市場家禽的IAV檢測。
　　一步反轉錄FRET-qPCR檢測甲型流感病毒方法的建立
　　本研究主要是基于68個IAV血清亞型的基質蛋白(M)基因，設計特異性引物和探針，建立一種一步反

3、轉錄FRET-qPCR檢測IAV的方法（PCR產(chǎn)物169 bp）。將特異性引物和探針進行BLAST檢索，證實與IAV血清亞型高度匹配的有122個，包含28，206個IAV序列。應用該方法對H1N1血清亞型病毒株制備的標準品進行檢測，表明其靈敏度達到10拷貝/反應;對9株IAV血清亞型病毒株(H1N1、H3N3、H4N6、H5N1、H6N1、H7N9、H9N2、H10N8、H11N2)的敏感性檢測，表明該方法優(yōu)于傳統(tǒng)的雞胚半數(shù)感染量(EI

4、D50)測定方法。此外，本試驗采集SPF雞的咽喉和泄殖腔拭子，加入不同稀釋度的H9N2，分別用于一步反轉錄FRET-qPCR方法和EID50試驗;并建立基于IAV聚合酶蛋白(PA)基因的反轉錄PCR方法(575 bp)，對一步反轉錄FRET-qPCR檢測的陽性樣品進行驗證。本研究建立的方法快速靈敏，可同時檢測出所有常見IAV血清亞型，為甲型流感疫情的監(jiān)測和防控提供重要技術支撐。
　　一步反轉錄FRET-qPCR檢測甲型流感病毒方法

5、的應用
　　從我國24省的活禽市場采集1，839只家禽（雞1，521只、鴨127只、鵝100只、鴿子91只）的咽喉和泄殖腔拭子樣品，應用本研究建立的一步反轉錄FRET-qPCR方法進行IAV檢測。結果表明，家禽IAV的陽性率為9.2％(169/1，839)，其中雞的IAV陽性率最高(10.4％;158/1，521)，其次是鴨(5.5％;7/127)，鴿子(4.4％;4/91)，鵝(0％;0/100);咽喉拭子的IAV陽性率(7.5

6、％;138/1，839)顯著高于泄殖腔拭子的IAV陽性率(5.2％;95/1，839;P＜10.4)，同時咽喉拭子含有的IAV拷貝數(shù)也明顯高于泄殖腔拭子(106.07 Vs.105.54;P＜104);咽喉和泄殖腔拭子均為陽性的家禽占總陽性家禽的27.8％(47/169)，僅咽喉拭子為陽性的家禽占47.9％(81/169)，僅泄殖腔拭子為陽性的家禽占24.3％(41/169)。
　　應用基于PA、血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)

7、基因的PCR方法，進一步對反轉錄FRET-qPCR檢測的陽性樣品進行IAV血清亞型判定。結果表明，在IAV陽性家禽樣品中，H9N2血清亞型占56.8％(96/169)，H7N9血清亞型占41.4％(70/169)，H5N1血清亞型占1.8％(3/169)。H9N2血清亞型的家禽包括雞(95.8％;92/96)和鴨(4.2％;4/96)，在96個H9N2血清亞型的家禽中，咽喉和泄殖腔拭子均為H9N2血清亞型的家禽占9.3％(9/96)，僅

8、咽喉拭子為H9N2血清亞型的家禽占71.9％(69/96)，僅泄殖腔拭子為H9N2血清亞型的家禽占18.8％(18/96); H7N9血清亞型的家禽包括雞(94.3％;66/70)和鴿子(5.7％;4/70)，在70個H7N9血清亞型的家禽中，咽喉和泄殖腔拭子均為H7N9血清亞型的家禽占51.4％(36/70)，僅咽喉拭子為H7N9血清亞型的家禽占15.7％(11/70)，僅泄殖腔拭子為H7N9血清亞型的家禽占32.9％(23/70);

9、 H5N1血清亞型僅在鴨中檢出(n=3)，其中2只的咽喉和泄殖腔拭子均為H5N1血清亞型，1只僅咽喉拭子為H5N1血清亞型。
　　綜上所述，本研究建立了基于M基因檢測IAV血清亞型的一步反轉錄FRET-qPCR方法，并通過基于PA、HA和NA基因的反轉錄PCR方法進行驗證。應用該方法對我國24省的活禽市場中家禽咽喉和泄殖腔拭子進行檢測分型的結果表明，家禽IAV的陽性率為9.2％(169/1，839)，其中雞的IAV陽性率最高(10

10、.4％;158/1，521);咽喉拭子的IAV陽性率(7.5％;138/1，839)顯著高于泄殖腔拭子的IAV陽性率(5.2％;95/1，839;P＜10-4)，同時咽喉拭子含有的IAV拷貝數(shù)也明顯高于泄殖腔拭子(106.07 Vs.10554;P＜10.4);在IAV陽性家禽樣品中，H9N2和H7N9血清亞型分別占56.8％(96/169)和41.4％(70/169)。本研究建立的一步反轉錄FRET-qPCR方法靈敏度高，能快速方便地