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1、目的:鑒定HBV nt250-453負(fù)性調(diào)節(jié)元件中存在的重要功能亞元件;研究HBV nt250-453負(fù)性調(diào)節(jié)元件對(duì)HBV復(fù)制的影響。 方法:構(gòu)建包含HBV nt453-434、nt403-384和nt283-264序列的蟲(chóng)熒光素酶基因表達(dá)質(zhì)粒,分別與內(nèi)參海參熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng),檢測(cè)蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)情況。逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)蟲(chóng)熒光素酶基因的mRNA水平。 結(jié)果:與pGL3-c
2、ontrol組比較,含有單個(gè)亞元件的重組質(zhì)粒組相對(duì)熒光素酶活性降低,分別為79.66%、80.79%、78.36%;含有2個(gè)亞元件的重組質(zhì)粒組進(jìn)一步降低至55.83%、56.27%、61.44%;含有3個(gè)亞元件的重組質(zhì)粒組的相對(duì)熒光素酶活性明顯降低,為pGL3-control組的38.83%。逆轉(zhuǎn)錄PCR.顯示熒光素酶的mRNA水平降低,與熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果相符合;Southern雜交檢測(cè)到HBV DNA復(fù)制中間體,與轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒L
3、J196+LJ96組相比較,轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒MLJ196+LJ96組的HBVrcDNA條帶無(wú)明顯差別。陰性對(duì)照組無(wú)雜交信號(hào)。 結(jié)論:HBV nt453-434、nt403-384和nt283-264序列為HBVnt250-453負(fù)性調(diào)節(jié)元件中發(fā)揮關(guān)鍵作用的三個(gè)亞元件;這三個(gè)亞元件可以獨(dú)立發(fā)揮作用;當(dāng)以協(xié)同的方式發(fā)揮作用時(shí),則表現(xiàn)出最強(qiáng)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用;HBV nt250-453負(fù)性調(diào)節(jié)元件對(duì)形成HBV復(fù)制中間體無(wú)影響,推測(cè)該負(fù)性調(diào)節(jié)元
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