中藥復(fù)方對胃粘膜細(xì)胞癌變的抑制與逆轉(zhuǎn)作用研究.pdf

1、胃癌發(fā)生發(fā)展的過程很少直接從胃粘膜上皮產(chǎn)生，而是由多基因異常引起的漸進(jìn)性的變化，在癌變前多數(shù)經(jīng)歷了較長的演變，即由正常胃粘膜轉(zhuǎn)變成為癌前病變，部分發(fā)展成胃癌。胃黏膜的腸上皮化生及不典型型增生主要存在于慢性萎縮性胃炎，雖然不典型型增生是公認(rèn)的癌前病變，有發(fā)展成腫瘤細(xì)胞的潛在趨勢，但是癌前病變是一個多步驟、多因素的復(fù)雜過程，不是所有的癌前病變都會發(fā)展成為胃癌，有的可以在進(jìn)程中停止發(fā)展，甚至發(fā)生逆轉(zhuǎn)或消失。此中藥復(fù)方由雪膽、老龍皮、白術(shù)、半枝

2、蓮、海螵蛸、黃芪組成。全方針對性強(qiáng)，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，符合中醫(yī)藥的“未病先防”思想，對胃癌癌前病變的預(yù)防和治療有非常重要意義。
　　 本文利用亞硝胺類化合物成功誘導(dǎo)出了胃癌癌前病變的細(xì)胞模型，并進(jìn)行了癌變相關(guān)蛋白的檢測，借助免疫印跡，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR等生物學(xué)檢測方法評價(jià)了中藥復(fù)方對癌前病變的細(xì)胞株以及惡性程度較高的細(xì)胞株中相關(guān)分子的影響，初步探究了其抑制和逆轉(zhuǎn)胃黏膜細(xì)胞癌變的作用。
　　 一、亞硝胺類化合物MNNG誘導(dǎo)G

3、ES-1細(xì)胞模型的建立
　　 使用與胃癌相關(guān)的亞硝胺類化合物N-甲基-N'硝基N-亞硝基胍(MNNG)對永生化的人胃粘膜上皮細(xì)胞系GES-1進(jìn)行惡性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，得到轉(zhuǎn)化后細(xì)胞，稱為MC細(xì)胞。比較觀察GES-1細(xì)胞和MC細(xì)胞的形態(tài)，檢測癌變相關(guān)蛋白N-cadherin，P-STAT3的表達(dá)。經(jīng)MNNG處理后的GES-1細(xì)胞（命名為MC），細(xì)胞的形態(tài)以及生長特性均發(fā)生了改變。隨傳代的延續(xù)，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“島樣”克隆生長。癌變相關(guān)蛋白N

4、-cadherin，P-STAT3的表達(dá)量增加。
　　 二、中藥復(fù)方對MNNG誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的抑制作用
　　 SRB法檢測中藥復(fù)方對GES-1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，免疫印跡檢測中藥復(fù)方對MNNG誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞中癌變相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、P-STAT3表達(dá)的影響，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測中藥復(fù)方對MNNG誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞中Snail，Twist基因的影響。SRB法檢測結(jié)果

5、顯示，中藥復(fù)方對GES-1細(xì)胞有一定的生長抑制作用，說明中藥復(fù)方在體外具有一定的抗腫瘤細(xì)胞增殖的活性，從中選出合適的給藥濃度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方下調(diào)MNNG誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞中癌變相關(guān)蛋白N-cadherin，P-STAT3表達(dá)的影響，上調(diào)了E-cadherin的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析中藥復(fù)方對MNNG誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞Snail，Twist的mRNA表達(dá)產(chǎn)生了一定的抑制作用。
　　 三、中藥復(fù)方對MGC-8

6、03細(xì)胞惡性程度的逆轉(zhuǎn)作用
　　 MTT法檢測中藥復(fù)方對MGC-803細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，劃痕法檢測中藥復(fù)方對MGC-803細(xì)胞遷移的影響，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測中藥復(fù)方對MGC-803細(xì)胞侵襲力的影響，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測中藥復(fù)方對MGC-803細(xì)胞克隆形成能力的影響，軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢測中藥復(fù)方對MGC-803細(xì)胞非錨著依賴性生長的影響，免疫印跡檢測中藥復(fù)方對MGC-803細(xì)胞中癌變相關(guān)蛋白N-cadherin，P-STAT3表

7、達(dá)的影響，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測中藥復(fù)方對MGC-803細(xì)胞中Snail，Twist基因的影響。MTT法檢測結(jié)果顯示，中藥復(fù)方對MGC-803細(xì)胞有一定的生長抑制作用，說明中藥復(fù)方在體外具有一定的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，從中選出合適的給藥濃度。劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，克隆形成實(shí)驗(yàn)，軟瓊脂實(shí)驗(yàn)表明中藥復(fù)方對MGC-803細(xì)胞遷移、侵襲、克隆形成以及非錨著依賴性生長都產(chǎn)生了較好的抑制作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方下調(diào)了MGC-

8、803細(xì)胞中癌變相關(guān)蛋白N-cadherin，P-STAT3表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析，中藥復(fù)方對MGC-803細(xì)胞Snail，Twist的mRNA表達(dá)產(chǎn)生了一定的抑制作用。
　　 本論文綜合利用現(xiàn)代藥理學(xué)和分子生物學(xué)檢測方法，成功建立了MNNG誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞模型。初步探討了中藥復(fù)方對于胃癌癌前細(xì)胞株以及惡性程度較高的癌細(xì)胞株的作用，揭示了此中藥復(fù)方對胃黏膜細(xì)胞癌變的抑制與逆轉(zhuǎn)作用，為此復(fù)方合理開發(fā)利用提供了科學(xué)的