誘導(dǎo)HIV-1中和抗體的膜蛋白抗原的優(yōu)化和改造.pdf

1、自1981年確認(rèn)首例艾滋病以來(lái)，艾滋病已成為對(duì)人類健康和社會(huì)穩(wěn)定威脅最大的感染性疾病之一。研制有效的艾滋病疫苗是控制艾滋病流行甚至根除AIDS的理想途徑。選擇合適的抗原作為免疫原以誘導(dǎo)強(qiáng)效、廣譜的中和抗體一直是疫苗研究的重要的基礎(chǔ)。HIV-1膜抗原位于HIV的表面，是中和抗體主要作用靶位。但天然HIV-1膜蛋白免疫原性低，很難誘導(dǎo)出強(qiáng)效廣譜的中和抗體，因而需要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化改造以提高中和表位的免疫原性，增強(qiáng)其誘導(dǎo)中和抗體的能力。本研究以一

2、株CRF07_BC亞型的假病毒株S939為原始株，對(duì)其膜區(qū)進(jìn)行改造以暴露某些保守中和表位，通過(guò)單抗、陽(yáng)性血清的中和試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證改造效果，最終獲得一株對(duì)中和性單克隆抗體和HIV-1感染陽(yáng)性血清均敏感、中和特性強(qiáng)的假病毒，為候選疫苗的抗原選擇和優(yōu)化提供依據(jù)。
　　本課題根據(jù)已知的單抗識(shí)別表位、已報(bào)道的能增強(qiáng)病毒對(duì)單抗敏感性的位點(diǎn)和N-連接糖基化位點(diǎn)為依據(jù)，對(duì)S939 Env設(shè)計(jì)突變，通過(guò)環(huán)形誘變，DpnI酶篩選的方式得到突變體，酶切初步

3、鑒定，測(cè)序確定突變結(jié)果。將含有突變env的真核表達(dá)質(zhì)粒與HIV-1骨架質(zhì)粒pSG3△env共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收集上清獲得假病毒，通過(guò)假病毒單輪感染TZM-bl細(xì)胞檢測(cè)假病毒滴度和突變位點(diǎn)對(duì)假病毒感染能力的影響。用HIV-1中和性單抗、HIV-1感染的陽(yáng)性血清來(lái)檢測(cè)改造位點(diǎn)對(duì)假病毒中和特性的影響。
　　單抗2F5、4E10識(shí)別gp41近膜區(qū)（MPER）上的線性表位，在S939上對(duì)該表位進(jìn)行聯(lián)合改造，改造后的假病毒FE相比原始株S

4、939感染力無(wú)顯著變化。FE對(duì)單抗2F5敏感性較S939提高11倍以上，對(duì)單抗4E10敏感性無(wú)明顯變化。在FE上進(jìn)行單抗2G12表位的改造（I295N、N334S和D386N）獲得假病毒株FE-2G12，其感染力較FE略微增強(qiáng)。2G12表位的改造沒(méi)有使假病毒FE-2G12對(duì)單抗2G12敏感，反而降低了對(duì)單抗b12和部分陽(yáng)性血清的敏感性。
　　在FE上進(jìn)行了8個(gè)已報(bào)道的增強(qiáng)病毒中和活性位點(diǎn)的改造，其中6個(gè)位點(diǎn)的突變I309L、L66

5、9S、G458A、T569A、I675V和D180N顯著降低了病毒的感染力，因而不能進(jìn)行其對(duì)病毒中和特性影響的評(píng)價(jià)。其余兩個(gè)突變中，S365A增強(qiáng)了病毒的感染力，F(xiàn)22L對(duì)病毒感染力無(wú)影響，這兩個(gè)突變均沒(méi)有增強(qiáng)病毒的中和活性。
　　以FE為模板，對(duì)25個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行單獨(dú)刪除，共獲得25個(gè)含有單個(gè)糖基化刪除的Env表達(dá)質(zhì)粒，并與pSG3△env質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞收獲假病毒。對(duì)這25個(gè)假病毒感染力的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中5個(gè)

6、分布在V1/V2，C1/C2區(qū)糖基化位點(diǎn)的刪除嚴(yán)重影響了病毒的感染力，含有這5個(gè)刪除位點(diǎn)的假病毒檢測(cè)不到其感染能力。分布在免疫反應(yīng)靜默面（immunologically-silent face domains）V4、C4和V5區(qū)域中的糖基化位點(diǎn)的刪除（除了N392(V4)）對(duì)假病毒的感染性有一定的增強(qiáng)。其他糖基化位點(diǎn)的刪除均不同程度的減弱了假病毒的感染能力。在假病毒中和特性方面，糖基化位點(diǎn)N197(C2)，N301(V3)，N442(C

7、4)和N625（gp41）的刪除使假病毒對(duì)部分HIV-1陽(yáng)性血清、抗CD4結(jié)合位點(diǎn)抗體b12和抗gp41抗體2F5和4E10更加敏感。N142(V1)的刪除使假病毒對(duì)單抗b12，2F5和4E10敏感性增強(qiáng)，但對(duì)HIV-1陽(yáng)性血清敏感性沒(méi)有影響。N355(C3)和N463(V5)的刪除使假病毒對(duì)2F5和4E10敏感性增強(qiáng)。
　　根據(jù)前幾部分的改造結(jié)果，選擇其中能對(duì)病毒中和活性顯著增強(qiáng)的位點(diǎn)，結(jié)合V5（N463、N466）和C3（N3

8、39）區(qū)的糖基化位點(diǎn)以及與N442臨近的N448的刪除，在FE上按不同組合進(jìn)行了聯(lián)合改造，共獲得了7株聯(lián)合突變假病毒，其中除197M-4外，均顯著降低了病毒的感染力。對(duì)其中6株假病毒的中和特性分析發(fā)現(xiàn)，相比于原始株S939、改造株FE以及單個(gè)糖基化位點(diǎn)的改造，聯(lián)合突變株對(duì)單抗2F5、4E10和b12，以及大部分陽(yáng)性血清，均顯示出了很強(qiáng)的敏感性。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)55個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變改造，發(fā)現(xiàn)了一些能夠顯著影響病毒感染能力的位點(diǎn)，