Frizzled1及相關蛋白在成釉細胞瘤中的表達與調控.pdf

1、前言：
　　成釉細胞瘤(ameloblastomas，ABs)是發(fā)生于頜骨內的腫瘤，大多數來源于牙齒正常發(fā)育完成后殘余的牙源性上皮剩余，少部分來自口腔黏膜上皮基底細胞、含牙囊腫、始基囊腫和角化囊腫襯里上皮的演變。在我國，其發(fā)生率約占牙源性腫瘤的63.2％。雖屬良性腫瘤，但其生長具有局部侵襲性，術后復發(fā)率較高，少數病例發(fā)生惡變后可導致區(qū)域性淋巴結、肺等遠處臟器轉移，甚至有發(fā)生骨轉移的報道，因此在治療上通常采取廣泛的外科手術切除。

2、r>　　Wnt信號通路是一個關鍵的信號通路，它控制胚胎發(fā)育和組織同源性的遺傳程序控制。Wnt/β-catenin信號分子在發(fā)育和維持內穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮了關鍵作用，許多遺傳性疾病、癌癥、慢性炎癥及其他疾病與Wnt信號通路中多種信號分子的異常相關。ABs是與牙齒發(fā)育有關的牙源性腫瘤，Wnt信號通路又是牙齒發(fā)育過程中所必不可少的信號調節(jié)通路。同時本課題組檢測了ABs中Wnt信號通路的下游因子表達情況:原位雜交方法結果顯示c-myc、cyclin

3、 D1 mRNA在ABs中表達增強，特別是復發(fā)和惡變病例;β-catenin、Axin2等在ABs中均有較高的陽性表達率及少數病例存在突變。推測此通路可能與ABs的發(fā)生、發(fā)展相關。
　　Wnt蛋白結合到富含半胱氨酸的frizzled蛋白的結構域上，啟動Wnt信號通路。 Fzd1是7次跨膜結構細胞表面受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族新成員，是Wnt信號通路的關鍵因子，與Wnt3a和Wnt7b配體結合激活經典Wnt信號通路。Wnt信號通路

4、的異常激活使腫瘤細胞內的β-catenin異常積聚，導致細胞異常增殖，引起腫瘤的發(fā)生。
　　最近報道Wnt/frizzled信號通路同樣參與炎癥進程的調節(jié)。Fzd1受體是一個炎癥反應巨噬細胞活性相關的新型標志物。Fzd1的表達依賴于TNF和NF-κB:Fzd1可以獨立于誘導TLR信號通路，TNF可以獨立誘導Fzd1 mRNA的表達。在炎性條件下，TNF在微生物中介導了Fzd1的表達，F(xiàn)zd受體表達將上調。在巨噬細胞反應中Fzd1參

5、與調控Wnt3a的信號通路。Wnt3a在經微生物刺激后通過降低TNF，影響巨噬細胞效應器功能。通過Wnt3a降低人單核細胞穿透內皮細胞層的遷移，從而降低炎癥反應，降低腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Wnt信號通路和TLR/NF-κB介導的信號通路之間相互影響，在進化過程中他們之間具有高度的保守信號轉導途徑。NF-κB是一類普遍存在的轉錄調節(jié)因子。NF-κB在抗細胞凋亡、促進細胞增殖、促進血管發(fā)生及促進腫瘤的浸潤和轉移方面也發(fā)揮著作用。
　　慢性

6、炎癥與一些惡性腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系，腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)病過程中起重要的作用。腫瘤相關巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的關鍵主導因素，可直接影響細胞生長?；罨蟮腡AM通過分泌TNF-α等多種細胞因子促進了腫瘤生成、侵襲、浸潤和轉移;該過程也是免疫調控中的重要環(huán)節(jié)。
　　研究Fzd1等Wnt信號分子在成釉細胞瘤腫瘤上皮及腫瘤微環(huán)境中的表達，為近一步探討Wnt信號通路在成釉細胞瘤發(fā)生中的作用與機制打下一定基礎。
　　材料與方法：

7、　　46例（附表）ABs樣本均來自2007年至2012年在中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)院外科和病理科，新鮮手術標本-80℃凍存。診斷標準依WH02005分類標準。以正常黏膜10例，KCOT14例，OSCC26例做對照，用RT-PCR方法檢測ABs中NF-κB mRNA表達情況;用Real-time PCR方法，以管家基因18srRNA校正，檢測ABs中Fzd1、Wnt3a、CD68及TNF-α mRNA表達情況;用Western-blot方法，以

8、GAPDH做內參，檢測Fzd1、Wnt3a及TNF-α蛋白表達;以β-actin做內參，檢測NF-κB蛋白表達;用免疫組化SP法觀察Fzd1、TNF-α、CD68及NF-κB在ABs瘤細胞內表達情況，以了解Fzd1、Wnt3a、CD68、NF-κB及TNF-α在ABs表達情況。探討影響Fzd1、Wnt3a、CD68、NF-κB及TNF-α基因在ABs中的表達機制，進而為ABs診斷和治療提供新的理論依據。
　　實驗結果：
　　

9、一、ABs中Fzd1、Wnt3a、CD68、TNF-α及NF-κB基因mRNA表達結果
　　用RT-PCR方法檢測了46例ABs中NF-κB mRNA表達情況，用Real-timePCR方法，以18srRNA做內參，檢測了46例ABs中Fzd1、Wnt3a、CD68、NF-κB及TNF-α mRNA表達情況。結果顯示:Fzd1在上皮的巨噬細胞中有表達，在腫瘤間質的巨噬細胞細胞中也有Fzd1的表達，ABs中Fzd1組的基因表達水平比

10、正常黏膜高0.139倍;Wnt3a基因表達水平比正常黏膜高1.44倍;CD68基因表達水平比正常黏膜高0.43倍;TNF-α基因表達水平比正常黏膜高0.47倍;NF-κB基因表達水平比正常黏膜高。
　　二、ABs中Fzd1、Wnt3a、TNF-α及NF-κB蛋白表達結果
　　用Western-blot方法，以GAPDH做內參，檢測了46例ABs中Fzd1、Wnt3a、TNF-α蛋白表達情況;以β-actin做內參，檢測NF-

11、κB蛋白表達;結果顯示，F(xiàn)zd1、Wnt3a、TNF-α、NF-κB在ABs中的表達明顯高于正常黏膜中的表達，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在ABs的各組織類型之間，F(xiàn)zd1、Wnt3a、TNF-α及NF-κB蛋白表達無明顯意義(P＞0.05)。
　　三、ABs中Fzd1、CD68、NF-κB及TNF-α免疫組化結果
　?。ㄒ唬〧zd1、NF-κB及TNF-α的表達:Fzd1、NF-κB及TNF-α蛋白在ABs和正常黏膜中

12、的表達有顯著差別(P＜0.001)，F(xiàn)zd1、NF-κB及TNF-α在ABs中的表達明顯高于在正常黏膜中的表達。Fzd1、NF-κB及TNF-α蛋白在ABs和OSCC中的表達情況有顯著差別(P＜0.001)，F(xiàn)zd1、NF-κB及TNF-α在OSCC中的表達明顯高于在ABs中的表達。Fzd1、NF-κB及TNF-α蛋白在ABs和KCOT中的表達情況差別無明顯差異(P＞0.05)，F(xiàn)zd1、NF-κB及TNF-α在KCOT和ABs中的表達

13、無明顯差異。
　?。ǘ〤D68的表達:CD68標記的巨噬細胞在ABs中表達，F(xiàn)zd1在ABs的腫瘤間質中的巨噬細胞亦可見陽性染色的表達，其它漿細胞，淋巴細胞等偶有陽性表達。
　?。ㄈ㏕AMs的表達:人成釉細胞瘤組中間質浸潤TAMs數量為22.7±2.5，正?？谇火つそM中間質浸潤TAMs數量為5.8±1.8，人成釉細胞瘤組較正?？谇火つそMTAMs數量較多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　?。ㄋ模㏕NF-α、NF

14、-κB、TAMs表達之間的關系:人成釉細胞瘤組中TNF-α蛋白與TAMs的表達呈正相關(P＜0.01)，NF-κB的表達與TAMs的浸潤數量呈正相關(P＜0.01)。
　　結論：
　　frizzled1、Wnt3a參與成釉細胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程，不僅可以通過介導Wnt信號通路影響成釉細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展，也可以影響炎癥過程，通過腫瘤炎性微環(huán)境參與成釉細胞瘤的疾病過程;CD68可以作為組織中巨噬細胞的標志，檢測腫瘤相關巨噬細胞在人