1,3-O,N螺雜環(huán)類(lèi)乙酰肝素酶抑制劑對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用.pdf

1、背景及目的：
　　宮頸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，隨著細(xì)胞學(xué)聯(lián)合病毒學(xué)篩查機(jī)制逐步完善及HPV疫苗的批準(zhǔn)使用，子宮頸癌的早期病變得以及時(shí)發(fā)現(xiàn)，世界范圍內(nèi)宮頸癌的發(fā)病率已明顯降低，但在發(fā)展中國(guó)家宮頸癌發(fā)病率逐漸增高和發(fā)病年輕化的勢(shì)頭并沒(méi)有得到有效遏制。而晚期、持續(xù)性和復(fù)發(fā)性宮頸癌是臨床處理的難點(diǎn)，治療緩解率低，目前主要是采用化療來(lái)緩解癥狀，減少腫瘤的負(fù)荷。許多臨床研究報(bào)告顯示，單一化療藥物不能很好提高患者的總生存率，多藥聯(lián)合化療提

2、高了反應(yīng)率，但對(duì)遠(yuǎn)期生存率并沒(méi)有顯著地改善。因而，需要開(kāi)發(fā)不同作用機(jī)制的藥物，探索新的治療方法，而分子靶向治療藥物成為人們解決宮頸癌治療困境的重要選擇。
　　腫瘤獲得侵襲與轉(zhuǎn)移能力依賴的一個(gè)重要方面就是基底膜完整性遭到破壞，其中，硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中非結(jié)構(gòu)蛋白的重要組成部分，它由一個(gè)核心蛋白通過(guò)糖苷鍵和數(shù)個(gè)與之共價(jià)連接的線性HS側(cè)鏈組成，其降解對(duì)于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要的促進(jìn)作用。乙酰肝素酶（

3、Heparanase,HPA）作為體內(nèi)唯一存在的內(nèi)源性糖苷類(lèi)內(nèi)切酶，其水解位點(diǎn)正是HSPG中硫酸乙酰肝素（ HS）側(cè)鏈與其核心蛋白相連的糖苷鍵，通過(guò)調(diào)節(jié)HSPG的結(jié)構(gòu)和功能影響生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞行為，其在許多惡性腫瘤中的高表達(dá)使其受到越來(lái)越多的關(guān)注，成為癌癥治療的分子靶點(diǎn)。在我們課題組之前的一系列研究中已經(jīng)證實(shí)HPA在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，癌組織轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)也顯著增高，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中乙酰肝素酶陽(yáng)性宮頸癌患者預(yù)后差。
　　本

4、研究以HPA為中心開(kāi)發(fā)新的靶點(diǎn)作用分子，設(shè)計(jì)合成了一系列1,3-O,N螺雜環(huán)類(lèi)HPA抑制劑，觀察它們對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用和對(duì)細(xì)胞周期、凋亡及HPA蛋白表達(dá)的影響，為宮頸癌HPA靶向抑制治療提供理論支持。
　　材料與方法：
　　通過(guò)改變 HS的吡喃糖苷類(lèi)模擬物 DMBO(2-(2,6-二氟苯基)-5-(4-甲氧基苯基)-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷)上取代基的種類(lèi)及位置，與鄭州大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院合作優(yōu)化設(shè)計(jì)合

5、成了兩個(gè)系列13種新的1,3-O,N螺雜環(huán)類(lèi)HPA抑制劑；利用乙酰肝素降解檢測(cè)試劑盒檢測(cè)化合物對(duì) HPA酶活性的抑制作用；復(fù)蘇并培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞株，MTT法和細(xì)胞劃痕法觀察抑制劑對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移抑制效應(yīng)；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化和凋亡狀況；細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞HPA蛋白表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:
　　1. HPA抑制劑對(duì)HPA酶活性的影響
　　除22號(hào)化合物（2-(2,4-二氟苯基)-5-(

6、4-甲氧基苯基)-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷）酶抑制作用不明顯外，所檢測(cè)的HPA抑制劑均可不同程度地抑制HPA酶活性(IC50值為4.47-47.19μM)，其中抑制作用最好的是14號(hào)（2-(2,6-二氟苯基)-5-苯基-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷），其次為16號(hào)（2-(2-氟苯基)-5-(4-甲氧基苯基)-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷）。
　　2. HPA抑制劑對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
　　所檢測(cè)的化合

7、物均可抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)(IC50值為48.158-96.641μM)，其中16號(hào)抑制劑對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，存在明顯的時(shí)間依賴和濃度依賴性，P<0.001。
　　3.化合物16號(hào)對(duì)HeLa細(xì)胞遷移效應(yīng)的影響
　　與對(duì)照組相比，50μM（接近IC50）16號(hào)抑制劑處理HeLa細(xì)胞24小時(shí)后可顯著抑制細(xì)胞遷移。
　　4.化合物16號(hào)對(duì)HeLa細(xì)胞周期及凋亡的影響
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：抑制劑處理后使

8、HeLa細(xì)胞阻滯在 G0/G1期和 G2/M期；50μM的16號(hào)抑制劑作用48小時(shí)后細(xì)胞凋亡率(（11.93±1.16）％)顯著高于對(duì)照組（（6.65±1.81）%），P=0.0131。
　　5.化合物16號(hào)對(duì)HeLa細(xì)胞HPA蛋白表達(dá)的影響
　　50μM的16號(hào)抑制劑處理細(xì)胞后,細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示處理組細(xì)胞爬片乙酰肝素酶蛋白平均光密度值（0.3933±0.0363）顯著低于對(duì)照組（0.5000±0.0937）， P=0.