豬胸膜肺炎放線桿菌外膜蛋白PalA對滅活疫苗的免疫干擾.pdf

1、豬胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）所造成的一種豬呼吸道疾病。該病在1957年P(guān)attison第一次報道，目前已經(jīng)遍布在全世界的各地，導(dǎo)致養(yǎng)豬行業(yè)的巨額經(jīng)濟損失。因為傳統(tǒng)的抗生素能夠所引起細(xì)菌的耐藥性，而且現(xiàn)代人極為廣泛關(guān)注綠色食品的安全問題，現(xiàn)階段預(yù)防和治療胸膜肺炎病普遍使用的方法就是接種疫苗。
　　在1996年Frey從胸膜肺炎放線桿菌中克隆了一種脂蛋白Pal

2、A，其大小約是14 kDa，PalA與流感嗜血桿菌P6蛋白和一種巴氏桿菌外膜蛋白同源性比較高，而后兩種已經(jīng)被證明是保護(hù)性蛋白，另外大量的實驗結(jié)果也表明有許多種類的革蘭氏陰性細(xì)菌中的PAL蛋白家族具有比較強的免疫原性特點，因此我們的目的蛋白PalA很有可能是治療豬胸膜肺炎候選亞單位疫苗的有效組成部分，令科學(xué)家驚奇的是，F(xiàn)rey在2003年的實驗研究中發(fā)現(xiàn)這種脂蛋白PalA對于亞單位疫苗有免疫有不利影響，我們知道目前滅活疫苗成本低而且在生產(chǎn)

3、實際中使用比較多，本研究主要是借助小鼠模型來探究PalA蛋白對于滅活疫苗免疫效力的影響。
　　首先，本實驗對目的基因palA進(jìn)行克隆和目的PalA蛋白表達(dá)純化，利用新西蘭大白兔為實驗對象進(jìn)行兔多克隆抗體的制備，實驗組的2只新西蘭大白兔用PalA免疫四次，另外一只免疫PBS作為陰性對照實驗，第二次加強免疫后的第十四天，將兔子動脈放血后進(jìn)行血清的徹底分離，然后利用96孔ELISA板測定制備的多克隆抗體血清的效價高低，我們實驗的測定結(jié)果

4、1∶25600，另外，實驗中提取了胸膜肺炎放線桿菌1型SLW01菌株的亞細(xì)胞的各個成分，通過Westernblotting分析最終顯示了目的PalA是一種外膜蛋白。
　　其次，我們利用純化的重組蛋白rPalA和胸膜肺炎放線桿菌SLW01滅活菌苗進(jìn)行了不同組合的皮下免疫小鼠后腹腔攻毒，實驗中選取了40只生理狀況相同的6周齡大的Balb/C雌性小鼠分成5個小組，第一組是用PBS免疫的對照組，第二組是rPalA組，第三組是胸膜肺炎放線桿

5、菌的SLW01滅活菌苗Bac組，第四組是蛋白疫苗混合BacPal組，第五組是胸膜肺炎放線桿菌的商品三價疫苗ComV組。免疫分三次進(jìn)行，每次的中間間隔時間是14天，第2次加強免疫兩周后，以～5×LD50劑量(2.5×106 CFU)的APP血清1型4074菌株腹腔攻毒，攻毒后記錄小鼠在一天后的體重變化和小鼠5天內(nèi)的死亡數(shù)量，計算各組小鼠的體重?fù)p失率和存活率，依據(jù)這些指標(biāo)分析目的蛋白rPalA對于滅活疫苗免疫效果的影響，每次免疫前和攻毒前對

6、小鼠進(jìn)行尾部的靜脈取血并且分離血清，利用間接ELISA測定小鼠血清對于三種不同的抗原rPalA，ApxⅠA，ApxⅡA的抗體水平。實驗結(jié)果顯示，第二組的PalA抗體效價極顯著高于第三組(P＜0.01)，然而，第三組滅活疫苗組卻顯示了比較高的外毒素ApxⅠA和ApxⅡA的抗體效價，最后一次免疫后外毒素的抗體效價差異達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01)。另外，第三組的免疫小鼠經(jīng)過APP血清1型4074菌株的攻擊后，表現(xiàn)了100％的保護(hù)，而Bac

7、Pal免疫的小鼠僅僅提供75％的保護(hù)，除此之外，相對于滅活疫苗組，BacPal免疫的小鼠體重?fù)p失顯著(P＜0.05)。
　　最后，我們用24只生理狀況相同的6周齡Balb/C雌性小鼠為實驗對象進(jìn)行了被動免疫實驗，將實驗動物隨機平均分成3組，分別用不同的抗血清皮下免疫，第一組免疫融合蛋白rPalA的抗血清，第二組免疫滅活的胸膜肺炎放線桿菌血清1型SLW01菌的抗血清，第三組免疫滅活A(yù)PP SLW01菌和rPalA混合抗血清，免疫抗血

8、清3h后，用APP血清1型菌株4074以～5×LD50(2.5×106 CFU)進(jìn)行腹腔攻毒，記錄小鼠5天內(nèi)的死亡率，并用福爾馬林將死亡小鼠的肺部固定然后制作病理切片，切片用H&E染色后鏡檢觀察。實驗結(jié)果表明，滅活疫苗組抗血清，BacPal的抗血清分別提供了的100％、37.5％的保護(hù)，病理切片的結(jié)果顯示滅活疫苗和目的融合蛋白rPalA混合的抗血清的肺部病變更加嚴(yán)重，肺部組織有出血和滲出的纖維蛋白。
　　總之，我們的實驗結(jié)果表明目