限制性與非限制性壓應力對椎間盤髓核細胞表達蛋白多糖的影響.pdf

1、椎間盤退行性變(Intervertebral Disc Degeneration,DDD)是現(xiàn)代社會影響人類生活質量的主要病癥之一。椎間盤主要由外部纖維環(huán)(Annulus Fibrosus,AF)及中央部髓核(Nucleus Pulposus,NP)組成,是連接相鄰兩個椎體的纖維軟骨盤,是一種粘彈性的固體材料,具有蠕變,松弛,滯后等特性。成人共有23個椎間盤,支撐人體上半身重量的同時吸收震蕩能量,并起到保護其中的中樞神經的作用。

2、　　 髓核細胞在維持椎間盤正常生理功能中起重要作用。隨著個體發(fā)育(AgingProcess),髓核細胞的組成在不同階段經歷復雜的變化;其中的脊索細胞逐漸消失,軟骨狀細胞逐漸增加。研究表明這種細胞組成的轉變,在椎間盤退行性變過程中有重要影響。由脊索細胞分泌的蛋白多糖與膠原組成的網絡可以形成腫脹壓以抵抗壓縮應力。生理狀態(tài)下線性的多聚糖鏈富含硫酸鹽與糖醛酸離子而呈負電性;當髓核受到外力擠壓時,水分大量滲出,離子濃度升高,引起滲透壓升高,不可

3、壓縮的蛋白多糖與膠原構成的固體線性網絡發(fā)生應變以抵抗壓縮應力;當外力消失時,高滲透壓將髓核組織周圍的水分重新吸收回來。
　　 椎間盤退行性變過程中,伴隨髓核中蛋白多糖、水分和Ⅱ型膠原減少;以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原、組織纖維化和硬度增加等現(xiàn)象。維持髓核細胞中蛋白多糖、膠原及水含量的穩(wěn)定對椎間盤的功能穩(wěn)定和發(fā)揮具有重要作用。大量研究表明力學環(huán)境對髓核細胞有重要影響,并且是引起椎間盤退行性變的一個重要因素之一。力學刺激對髓核細胞的影響包括其

4、細胞組成、細胞外基質的分泌、含水量等。脊椎的主要功能是為軀干提供力學支撐,并且為軀干的各種運動提供條件。日常生活中,由于人體不同的姿勢,致使椎間盤受到力學刺激方式較復雜,通常是壓縮、彎曲和扭轉的組合,但其中壓縮應力是最主要的。髓核在承受壓縮應力時,髓核部位產生靜水壓,通過靜水壓將壓縮應力均勻地傳遞到周圍的纖維環(huán),避免椎間盤的某一部位因過度承載而發(fā)生損傷,具有平衡壓縮應力的作用。髓核組織產生靜水壓對纖維環(huán)的張力,根據(jù)力的相互原理,纖維環(huán)同

5、時對髓核組織產生一定的擠壓應力。所以髓核在體內受壓應力時不僅受到軸向的壓力,縱向上還同時受到一定程度上纖維環(huán)的擠壓,即一定程度限制性壓應力加載。由于纖維環(huán)的彈性、滲透性等特征及纖維環(huán)組織本身在不同個體、不同健康狀態(tài)之間有不同的幾何結構,使這種限制性應力加載比較復雜,稱不上是嚴格意義的限制性加載,而是伴有一定程度的非限制性壓應力加載。迄今為止,關于這兩種力學模型對髓核細胞表達及分泌細胞外基質的影響尚未見報道。為了研究這兩種力學模型(限制性

6、與非限制性)對髓核細胞的影響,本文研究中我們用大鼠的髓核細胞對其施加周期性應力和靜態(tài)應變力學刺激,以研究這兩種力學模型對髓核細胞表達蛋白多糖的影響。我們的主要研究工作和結果如下:
　　 ①限制性和非限制性力學模型對髓核細胞表達蛋白多糖的影響從大鼠尾部原代培養(yǎng)獲取髓核細胞,并將其種入藻酸鹽凝膠中進行3D培養(yǎng),24小時候后,分別施加周期性10 kPa的機械壓應力和20％的靜態(tài)應變。收集細胞樣品后,經Real time PCR檢測蛋白

7、多糖基因表達。實驗結果表明,與無應力對照組相比,周期性動態(tài)應力加載使Glypican、Biglycan、Fibromodulin基因表達都呈上調趨勢,Aggrecan、Laminin以及Fibronectin基因表達保持不變;而Lumican基因表達的上調只發(fā)生在非限制性力學模型中。而靜態(tài)應變加載中,Lumican基因表達在非限制性模型中呈下降趨勢,相反在限制性模型中基因表達上調;其他基因表達在20％的應變下都得到增強。為了解釋這一現(xiàn)象

8、,我們猜測Lumican基因表達可能與細胞、細胞核形變存在一定關聯(lián)。為了證實這一假設,將髓核細胞接種在藻酸鹽凝膠中進行3D培養(yǎng),經熒光染料染色后分別通過限制性與非限制性模型對藻酸鹽凝膠施加20％應變,熒光顯微鏡下觀察細胞、細胞核形變,并通過Image J軟件分析。結果表明無論是周期性應力加載還是靜態(tài)應變加載,非限制性模型中髓核細胞、細胞核都發(fā)生較大形變,這一結果無法解釋Lumican基因表達在周期性應力與靜態(tài)應變試驗中呈相反趨勢這一現(xiàn)象

9、,這與我們的預先假設不符;
　　 ②線性雙相模型對藻酸鹽凝膠內壓強的計算為了進一步探求引起Lumican基因表達上調的可能因素,我們利用雙相線性數(shù)學模型對限制性加載模型中藻酸鹽凝膠內部各位點的應變和壓強分布進行分析。模型中,假設藻酸鹽凝膠主要由理想流體(主要是水)和不可壓縮的凝膠基質兩部分組成。計算結果表明在限制性力學模型中,20％的應變下,藻酸鹽凝膠內部持續(xù)存在壓強差,即藻酸鹽凝膠內部持續(xù)存在一定的剪切力。
　　 ③流

10、體剪切應力上調Lumican基因、蛋白表達為了驗證流體剪切力是否可以引起Lumican表達上調,將原代培養(yǎng)獲得的大鼠髓核細胞接種在涂有Matrigel的載玻片上,然后通過流動腔對其施加不同大小(0.4dyn/cm2、ldyn/cm2)的流體剪切力,收獲細胞RNA,經Real time PCR和Western Blot實驗分別檢測Lumican基因和蛋白表達。實驗結果表明,ldyn/cm2的流體剪切力上調Lumican基因及蛋白表達。據(jù)我

11、們所了解,這是第一次報道流體剪切力能引起髓核細胞中Lumican表達變化。
　　 ④流體剪切應力激活髓核細胞ERK磷酸化并引起細胞骨架重排為了進一步研究流體剪切力對髓核細胞的影響,我們結合相關文獻,發(fā)現(xiàn)流體剪切力可以激活髓核細胞中MAPK家族中ERK的磷酸化,通過進一步實驗發(fā)現(xiàn)這一過程和Actin蛋白骨架密切相關,流體剪切應力可以引起Cytokeratin8細胞骨架的重排。
　　 綜上所述,本文用藻酸鹽凝膠對髓核細胞3D

12、培養(yǎng),并且通過限制性和非限制性力學模型對其施加動態(tài)和靜態(tài)力學刺激,以檢測不同力學加載方式對髓核細胞的影響,發(fā)現(xiàn)不同力學加載方式引起蛋白多糖Lumcian基因表達呈不同趨勢。進一步通過雙相線性數(shù)學模型計算,發(fā)現(xiàn)在靜態(tài)應變加載中,藻酸鹽凝膠在限制性加載過程中存在持續(xù)的流體剪切力,推測正是這種內部流體剪切應力參與了髓核細胞調節(jié)Lumican表達的變化。經過進一步實驗證實了這一假設并且發(fā)現(xiàn)髓核細胞在流體剪切力作用下通過激活ERK磷酸化和蛋白骨架