表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒研究.pdf

1、西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)屬黃病毒科黃病毒屬，經(jīng)蚊媒傳播，多種鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物對(duì)該病毒易感，是一種重要的人獸共患傳染病病原，野生鳥(niǎo)類(lèi)尤其是烏鴉為WNV的儲(chǔ)存宿主，人群對(duì)WNV普遍易感，人感染后可導(dǎo)致西尼羅熱，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、腦炎甚至死亡等。
　　目前針對(duì)WNV尚無(wú)特異性治療方法，亦無(wú)人用WNV疫苗。急需開(kāi)展WNV防控相關(guān)研究，WNV研究中相關(guān)病毒操作需在較高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，如生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室

2、(BSL-3)，活病毒操作存在感染與泄露風(fēng)險(xiǎn)，制約了WNV疫苗及藥物的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)擬建立表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的限制性復(fù)制WNV，為WNV中和抗體檢測(cè)、抗病毒藥物篩選及感染機(jī)制研究建立技術(shù)平臺(tái)。
　　本研究參考WNVNY99株基因組序列，分段合成除結(jié)構(gòu)蛋白基因外的其它基因組序列，在缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因位置插入gfp報(bào)告基因序列，并按WNV基因組順序克隆于pCI-neo載體中，構(gòu)建含有GFP蛋白基因的重組WNV復(fù)制子質(zhì)粒pW

3、NVrepdCME-GFP。同時(shí)構(gòu)建表達(dá)WNV C蛋白的重組質(zhì)粒pCAG-WNV-C、穩(wěn)定表達(dá)WNV PrM/E蛋白的細(xì)胞系BWNV-ME及穩(wěn)定表達(dá)WNVC/PrM/E蛋白的細(xì)胞系BWNV-CME。當(dāng)復(fù)制子質(zhì)粒pWNVrepdCME-GFP和表達(dá)C蛋白的質(zhì)粒pCAG-WNV-C共轉(zhuǎn)染BWNV-ME細(xì)胞，或用復(fù)制子質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)C/PrM/E的細(xì)胞系BWNV-CME時(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞都能夠表達(dá)GFP，均可包裝得到高滴度WNV復(fù)制子顆粒(＞

4、106 PFU/mL)，包裝得到的WNV復(fù)制子顆粒命名為RRPs。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液接種BHK-21細(xì)胞后，能感染細(xì)胞并且表達(dá)GFP。然而，感染BHK-21細(xì)胞的培養(yǎng)液不能再感染BHK-21細(xì)胞，說(shuō)明RRPs只具有一次感染能力;而感染BWNV-CME細(xì)胞時(shí)，由于細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)WNV全部結(jié)構(gòu)蛋白，所以能夠不斷包裝出子代病毒，在BWNV-CME細(xì)胞中可類(lèi)似于活病毒復(fù)制繁殖且造成細(xì)胞病變。如果在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入羧甲基纖維素，釋放的RRPs只能

5、由最初感染的細(xì)胞向周邊擴(kuò)展，一定時(shí)間后，便形成一個(gè)局限性病變細(xì)胞區(qū)，此即病毒噬斑。感染實(shí)驗(yàn)表明RRPs對(duì)Vero、HEK-293、BHK-21和SK-N-SH四種不同類(lèi)型細(xì)胞有不同嗜性，且對(duì)Vero易感性最高，與文獻(xiàn)報(bào)道WNV活病毒感染細(xì)胞特性一致，可用于WNV入侵細(xì)胞機(jī)制研究。根據(jù)RRPs在BWNV-CME細(xì)胞系中能夠復(fù)制并形成噬斑，我們建立了噬斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)，用于中和抗體檢測(cè)和抗病毒藥物篩選。用PRNT實(shí)驗(yàn)對(duì)WNV VL

6、P亞單位疫苗免疫的鼠、鵝和馬血清進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)小鼠血清測(cè)得中和抗體效價(jià)為1∶80～1∶160，與用WNV活病毒測(cè)定的結(jié)果相符合。ELISA測(cè)得的鵝和馬陽(yáng)性血清用PRNT實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)也呈陽(yáng)性，抗體效價(jià)可達(dá)1∶160～1∶320。這些結(jié)果表明所包裝得到的的RRPs可以代替活病毒用于中和試驗(yàn)，能夠用于疫苗免疫效果評(píng)價(jià)。RRPs感染BWNV-CME細(xì)胞過(guò)程中加入不同濃度抗WNV藥物Ribavirin和6-Azauridine，結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同濃度的