CALM1基因SNP多態(tài)性與青少年特發(fā)性脊柱側凸遺傳易感性的關聯(lián)研究.pdf

1、[研究背景]特發(fā)性脊柱側凸(Idiopathicscoliosis，IS)是最常見的脊柱畸形，發(fā)病率約1％～3％，其中，青少年特發(fā)性脊柱側凸(Adolescentidiopathicscoliosis，AIS)約占80％。雖然AIS的病因還不明確，但隨著分子生物學和遺傳學水平的發(fā)展，AIS的遺傳病因?qū)W研究逐漸深入。目前，人們普遍認為它是一種多因素作用的遺傳性疾病，且有學者采用全基因掃描法將AIS相關基因定位于有限的幾個染色體位點。

2、 對于研究復雜多基因相關疾病，候選基因法、關聯(lián)分析、單倍體型分析法具有先進和準確的特點，如今它們已成為群體遺傳學研究和疾病相關基因檢測的重要手段，能夠直接、簡便、準確地闡述疾病相關基因的關聯(lián)性和作用機制。 另外，AIS作為一種臨床表型復雜的疾病，目前尚無從不同的臨床表型角度如PUMC分型，分組分層對AIS不同臨床表型的遺傳病因?qū)W機制進行研究的相關報道。 [研究目的] 1.通過對鈣調(diào)蛋白1基因(Calmoduli

3、n1，CALM1基因)與AIS之間的關聯(lián)分析，明確其在AIS發(fā)病機制中發(fā)揮的效應。 2.通過對CALM1基因SNPs位點等位基因/基因型與AIS臨床表型的關聯(lián)分析，在基因水平上探索CALM1基因與AIS不同臨床表型之間的關系，從遺傳學上豐富AIS臨床表型的內(nèi)容。 3.根據(jù)研究結果提出可能的AIS病因?qū)W假說。 [研究方法] 本實驗采用以醫(yī)院為基礎的“病例-對照”研究。 1.研究對象：根據(jù)入選和排除標

4、準選取2005年10月至2008年2月期間北京協(xié)和醫(yī)院骨科收治并已確診的漢族青少年特發(fā)性脊柱側凸患者，共146例，其中男性24例，女性122例，平均年齡14.89歲(10～20歲)。對照組則為同期北京協(xié)和醫(yī)院收治的感染或創(chuàng)傷患者、健康查體者等漢族患者，共146例，男性24例，女性122例，平均年齡15.18歲(10～20歲)。 2.研究方法 (1)QIAamp()DNABloodMiniKit試劑盒提取DNA；

5、(2)根據(jù)國際人類基因組單倍體型圖計劃(http：//www.hapmap.org/)提供的基因型數(shù)據(jù)，應用Haploview4.0軟件選取CALM1基因的SNPs位點，優(yōu)先選取雜合度高于10％，位于外顯子區(qū)域或有錯義突變的SNPs和位于3’-、5’-調(diào)控區(qū)的SNPs作為遺傳標記、共選取14個SNPs： (3)分別按照側凸頂點所在位置(主彎)、PUMC分型對病例組進行分組； (4)在所有146例AIS患者和146例對照組

6、中應用超高通量的SNP分型系統(tǒng)--SNPstreamUHTGenotypingSystem對所選SNPs進行基因型鑒定； (5)擬合優(yōu)度×2檢驗(Goodness-of-fitChi-squaretest)分析病例、對照組基因型頻率的分布是否符合H-W平衡； (6)基于基因型/等位基因頻率的“病例-對照”關聯(lián)分析及病例組不同臨床表型之間的關聯(lián)分析； (7)在基因型/等位基因頻率關聯(lián)分析基礎上，應用在線軟件(SNP

7、stats)進行非條件Logistic回歸模型評估單位點基因型與AIS發(fā)生風險的相關程度，并計算優(yōu)勢比(OR)及95％可信區(qū)間(CIs)； (8)連鎖不平衡和單倍體型分析：應用Haploview4.0軟件計算CALM1基因所有單倍體型在病例組和對照組之間的分布差異。 [研究結果] 1.流行病學資料分析：病例組和對照組之間年齡、性別分布無統(tǒng)計學差異。 2.因rs12885713、rs5871引物設計失敗，故

8、研究中放棄這兩個位點，最終對CALM1基因的12個SNPs位點進行統(tǒng)計分析，這12個SNPs位點均具有多態(tài)性，其等位基因和基因型在病例組和對照組中均符合Hardy-Weinberg平衡。 3.SNPs等位基因多態(tài)性-AIS:rs2300496、rs2300500和rs3213718等位基因在病例組和對照組中的分布頻率統(tǒng)計學上存在顯著差異(P值分別為0.0079，0.0079，0.0257)，進一步分析得知rs2300496位點等

9、位基因C、rs2300500位點等位基因G和rs3213718位點等位基因C與AIS的易感性升高有關。 4.基因型多態(tài)性-AIS (1)rs2300496、rs2300500和rs3213718基因型在病例組和對照組中的分布頻率統(tǒng)計學上存在顯著差異(P值分別為0.0196，0.0196，0.0378)，進一步分析得知rs2300496基因型C/C、rs2300500基因型G/G和rs3213718基因型C/C與AIS的易

10、感性升高有關。在非條件Logistic回歸分析中，經(jīng)年齡和性別校正后，rs2300496和rs2300500基因型分布符合Codominant遺傳模型(OR=0.12，95％CI=0.01-0.99，p=0.015，AIC=402.4)、Dominant遺傳模型(OR=0.56，95％CI=0.34-0.92，p=0.022，AIC=403.6)和Log-additive遺傳模型(OR=0.54，95％CI=0.35-0.86，p=0.

11、0073，AIC=401.6)，后者最佳(AIC值較小)；rs3213718基因型分布符合Log-additive遺傳模型(OR=0.60，95％CI=0.39-0.93，p=0.022，AIC=403.5)。 (2)單倍體-AIS：在多位點單倍體型分析中，發(fā)現(xiàn)1種陽性單倍體型：SNP8C-SNP1A-SNP13C-SNP14C-SNP2C-SNP3T-SNP4G-SNP5T-SNP11C。 (3)結合PUMC分型，rs

12、2300496和rs2300500基因型在PUMCⅡ型和對照組中的分布頻率統(tǒng)計學上存在顯著差異(P值分別為0.0470，0.0470)，進一步分析得知rs2300496基因型C/C、rs2300500基因型G/G與PUMCⅡ型的發(fā)生有關。 (4)結合AIS主彎頂點分析，rs2300496、rs2300500和rs3213718基因型在胸彎和對照組中的分布頻率統(tǒng)計學上存在顯著差異(P值分別為0.0180，0.0180，0.0402

13、)，進一步分析得知rs2300496基因型C/C、rs2300500基因型G/G和rs3213718基因型C/C與胸彎的發(fā)生有關。 (5)12個SNPs位點基因型與病例組主側彎Cobb’s角度數(shù)之間無統(tǒng)計學差異。 [結論] 1.CALM1基因遺傳變異可能與青少年特發(fā)性脊柱側凸(AIS)發(fā)生相關，有可能是影響AIS易感性的重要因素。 2.PINCⅡ型AIS的發(fā)生可能與：rs2300496和rs2300500