青少年特發(fā)性脊柱側凸椎間盤軟骨終板蛋白質組研究.pdf

1、研究背景：青少年特發(fā)性脊柱側凸(AIS)是一種脊柱三維畸形，當青少年脊出現(xiàn)結構性側凸(冠狀面X線平片上Cobb角>10℃，合并脊柱的旋轉畸形)，而無其他器質性疾病時，可以臨床上診斷此疾病。AIS是兒童及青少年骨骼肌肉系統(tǒng)最常見的畸形之一。正如它命名中“特發(fā)性”所指，盡管學者們做了大量研究，但迄今為止它的病因仍然不明，這就給它的早期干預、早期治療帶來了一定困難。 盡管AIS的發(fā)病原因尚不清楚，但經過多年的研究，一些科學家或科研機構

2、一經提出了可能與脊柱側凸發(fā)生和發(fā)展相關的一些假說：如家族遺傳因素學說，生長發(fā)育學說和結締組織異常學說等諸多觀點問世，但各種論點所得出的結論都不能很好地進行重復性試驗。所以大部分學者認為，AIS是一個涉及多遺傳易感基因位點和多系統(tǒng)致病環(huán)節(jié)，引發(fā)多種損害效應的蛋白質分子表達異常的疾病。單基因和單一蛋白質分子的研究已經進入了一條無法繼續(xù)前行的死胡同。從脊柱側凸病因學的報告文獻中可以發(fā)現(xiàn)，近五年來已經沒有新的觀點或發(fā)現(xiàn)問世。 椎間盤不對

3、稱是引起AIS畸形產生和進展的結構基礎。從解剖學和影像學檢查中不難發(fā)現(xiàn)，凸側椎間盤的發(fā)育較凹側明顯成熟。從解剖學和影像學檢查中不難發(fā)現(xiàn)，凸側椎間盤的發(fā)育較凹側明顯成熟。椎間盤由纖維環(huán)環(huán)繞凝膠狀的髓核及覆蓋于此結構的上下軟骨終板組成。軟骨終板通常厚度不到1mm，由透明軟骨組成，它將椎體和間盤纖維環(huán)及髓核隔開。椎間盤作為人體內最大的無血管組織，除纖維環(huán)外圍極少數幾層環(huán)狀纖維板通過臨近血管進行營養(yǎng)代謝外，其余椎間盤組織則需要通過軟骨終板的彌散

4、作用完成營養(yǎng)獲取和代謝物的排出。Driscoll M等研究發(fā)現(xiàn)椎間盤的不均衡發(fā)育程度和AIS的進展呈正相關；另外，與Lonstein JE的結論相同，并且通過比較凸、凹側椎間盤差異的大小可以預測AIS患者側凸畸形的進展速度和畸形所能達到的嚴重程度。 研究發(fā)現(xiàn)，凸、凹側脊柱軟骨終板的細胞活動和組織成熟度差異有可能影響脊柱側凸的進展。組織學研究表明，側彎頂椎凸、凹側軟骨終板的細胞活動和組織成熟度存在明顯的差異。在脊柱后凸畸形和側凸畸

5、形的患者中，能夠觀察到椎間盤出現(xiàn)形明顯的態(tài)學上變化。其中最為引入注目的一點就是在脊柱側凸患者的軟骨終板內不同程度異常鈣化的出現(xiàn)。這種鈣化的通常由細胞的兩極開始出現(xiàn)，逐漸環(huán)繞整個細胞，進而擴散至到細胞外基質。這種異常鈣化影響了椎間盤組織的營養(yǎng)供應和物質代謝，進而可能影響椎間盤的生長和發(fā)育。 AIS脊柱畸形通常開始于青春期患者生長發(fā)育起始階段，而此前并未出現(xiàn)脊柱的側凸畸形及椎間盤的不對稱生長。在由正常—異常的生長發(fā)育過程中，側凸部位

6、的椎間盤和終板的必然發(fā)生了某些變化。蛋白質作為生物生理功能過程中最重要的一類分子，必然會在這種變化中發(fā)揮重要的作用。近年來蛋白質組學研究技術的發(fā)展為AIS的研究帶來了新的動力。通過對比不同組織樣品中的蛋白質組，可以直觀地了解二者之間在分子水平上有何不同。 研究目的： 1.分別鑒定凸側和凹側椎間盤軟骨終板的蛋白質組。 2.比較二者之間的差異。 3.嘗試尋找引起椎間盤不對稱發(fā)育的關鍵蛋白。 研究方法：

7、 1.研究對象： 根據納入和排除標準確定2006年7月—2007年8月期間北京協(xié)和醫(yī)院脊柱外科收治并確診的6例青少年脊柱側凸(AIS)患者。 2.技術方法： ·側凸頂點軟骨終板組織獲取和處理：通過前路脊柱側凸矯形手術，手術醫(yī)師在術中完整取得側凸頂點軟骨終板；去除軟骨組織表面附著的纖維環(huán)和骨組織，充分清洗確保無血細胞殘留。 ·軟骨組織蛋白質提取：使用組織切片、洗脫、蛋白質沉淀技術直接獲取軟骨組織蛋白

8、質。 ·測定蛋白質濃度并進行SDS-PAGE蛋白質樣品電泳分析。 ·質譜分析：使用二維液相色譜串聯(lián)電噴霧離子阱質譜(2D—LC—LTQ)技術進行蛋白質質譜分析。 ·數據處理：質譜數據使用SEQUEST對humanref蛋白質數據庫(Version9.18)進行解讀，并用Bioworks3.2將結果進行過濾，分類和顯示。由SwissProt和TrEMBL蛋白庫的搜索結果給蛋白標注上名稱。 研究結果：

9、 ·軟骨組織中獲得的平均蛋白質濃度為3.02mg/ml(2.20-3.97mg/ml)。 ·聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳(SDS-PAGE)發(fā)現(xiàn)，凸側蛋白質樣品在蛋白質總量和種類二方面均較凹側蛋白樣品顯著增加。 ·凸側樣品鑒定出103種蛋白，凹側鑒定出55種蛋白，其中凸、凹側共有的蛋白45種，凸側特有蛋白58種，凹側特有蛋白10種。 ·在凸側發(fā)現(xiàn)的蛋白質中發(fā)現(xiàn)至少3種具有促進細胞和組織成熟、分化功能的蛋白質；而凹側特有