中國漢族人群PAX1-SIM2-WNT3A-TBX6-DVL2-LMX1A基因多態(tài)性與先天性脊柱側(cè)凸遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究背景： 近20年通過對小鼠的胚胎學(xué)研究獲得了人量關(guān)于脊椎發(fā)育的分子胚胎學(xué)信息，研究進(jìn)展表明對于物種進(jìn)化來說不同物種間在核苷酸序列和氨基酸序列上有較高的保守性。因此此我們可以系統(tǒng)回顧有關(guān)小鼠骨骼、尾部或神經(jīng)肌肉突變表型的基因組數(shù)據(jù)以發(fā)現(xiàn)人類CS的可能候選基因，通過基因圖的位置以同線性保守基因為基礎(chǔ)進(jìn)一步確立人類的可能候選基因。Giampietro等2003年報道利用人-小鼠同線性分析發(fā)現(xiàn)了小鼠的27個突變基因座及對應(yīng)的人類CS

2、的候選基因，還推薦了7個重要的候選基因--PAX1、DLL2，WNT3A、MYLK、LMXL4、FBN2和SIM2。從小鼠基因組數(shù)據(jù)庫中我們還可發(fā)現(xiàn)TBX6、DVL2等基因也是人類CS的候選基因。 研究目的： ■通過對7個候選基因上的SNPs的篩查探索候選，探索候選基因與人類CS之間的關(guān)聯(lián)，依據(jù)研究結(jié)果提出可能的病因?qū)W假說■通過候選基因SNPs基因型與CS臨床表型的關(guān)聯(lián)分析，探索可能潛在的致病基因，從遺傳學(xué)學(xué)上豐富CS臨

3、床表型的內(nèi)容■從基因水平探索候選基因與CS及CS不同臨床表型之間的關(guān)系節(jié)研究方法：本研究采用醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對照研究設(shè)計。 ■研究對象：根據(jù)入選和排除標(biāo)準(zhǔn)入選2005年10月--2007年9月期間北京協(xié)和醫(yī)院收治并已確診的127例中國漢族先性天性脊柱側(cè)凸(CS)患者。127例非先天性脊柱側(cè)凸對照為性別、年齡、民族與病例相匹配，年齡差別≤3歲的同期北京協(xié)和醫(yī)院收住的感染(43％)、炎癥性疾病(41％)、創(chuàng)傷(11％)、過敏性疾病

4、及其他(5％)患者。 ■研究方法： ◇QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取全血DNA； ◇根據(jù)國際人類基因組單體型圖計劃(http：//www.Hapmap.org)提供的基因型數(shù)據(jù)，應(yīng)用Haploview 4.0軟件選取各候選基因的標(biāo)簽SNPs，優(yōu)先選取雜合度高于10％，位于顯子區(qū)域或有錯義突變的SNPs和位于3'-、5'-調(diào)控區(qū)的SNPs作為遺傳標(biāo)記，共選取24個SNPs； ◇

5、將病例組根據(jù)椎體畸形特點(diǎn)、畸形部位、椎體畸形受累程度、有無合并骨畸形和有無合并椎管內(nèi)內(nèi)畸形進(jìn)一步分為不同的臨床表型； ◇在所有127例CS患者和127例對照中應(yīng)用超高通量的SNP分型系統(tǒng)--SNPstream UHT Genotyping System對所選SNPs進(jìn)基因型鑒定； ◇擬合優(yōu)度X檢驗(Goodnessof-fit Chi-square test)分析病例、對照組基因型頻率的分布是否符合H-W平衡；

6、◇基于基因型/等位基因頻率的關(guān)聯(lián)分析： ◇在基因型/等位基因頻率關(guān)聯(lián)分析基礎(chǔ)上，應(yīng)用在線軟件(SNPstats)進(jìn)行非條件Logistic 回歸模型評估單位點(diǎn)基因型與CS發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)程度，并計算優(yōu)勢比(OR)及95％可信區(qū)間(Cls)； ◇連鎖不平衡和單倍體型分析：應(yīng)用Haploview 4.0和UNPAHSED軟件計算對照組人群中間……,基因SNPs 兩兩間連鎖不平衡統(tǒng)計值D 和r2，并評估所有單倍體型在病例和對照組

7、之間的分布差異。 研究結(jié)果： ■先天性脊柱側(cè)凸(CS)病例組和對照組年齡、性別分布無統(tǒng)計學(xué)差異。 ■因DLL3基因的3個標(biāo)簽SNPs引物設(shè)計失敗，故研究中放棄該基因；最終對于篩查所得到的分布于6個基因(PAX1，SIM2、WNT3A、TBX6、DVL2、LMXIA)的20個SNPs數(shù)據(jù)行統(tǒng)計分析，20個SNP 位點(diǎn)均具有多態(tài)性。 ■P4X1 基因篩選兩個位點(diǎn)：SNP1(rs17861031)和SNP2(r

8、s6047590)，其基因分布在病例組和對照組中均符合Hardy-Weinberg 平衡；兩位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡；兩位點(diǎn)的基因型/等位基因與CS的發(fā)生風(fēng)險之間不存在相關(guān)性。 ■SIM2 基因其篩選3個位點(diǎn)：SNP3(rs2073601)、SNP4(2073417)和SNP5(2051397)，其中SNP4基因型分布在病例組和對照組中不符合Hardy-Weinberg 平衡，另兩個位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡；

9、三位點(diǎn)兩兩間不存在連鎖不平衡；三個位點(diǎn)的基因型/等位基因與 CS的發(fā)生風(fēng)險之間不存在相關(guān)性。 ■WNT3A 基因共篩選2個位點(diǎn)：SNP6(rs964941)和SNP7(rs752107)，其因型分布在病例組和對照組中均符合 Hardy-Weinberg 平衡：兩化點(diǎn)間不存在連鎖不平衡；兩位點(diǎn)的基因型/等位基因與CS的發(fā)生風(fēng)險之間不存在相關(guān)性。 ■TBX6 基因其篩選2個位點(diǎn)：SNP8 (rs2289292)和SNP9(r

10、s3809624)，其基因分布在對照組中均符合Hardy-Weinberg平衡，但在病例例組中，不符合Hardy-Weinberg 平衡；病例/對照組中等位基因分布頻率分別為：SNP8C=108(0.43)/135(0.53)，SNP8T=146(0.57)/119(0.47)，SNP9C=144(0.57)/120 (0.47)，SNP9T=110 (0.43)/134(0.53)，單位點(diǎn)分析顯示兩位點(diǎn)等位基因在病例和對照組中的分布頻

11、率統(tǒng)汁學(xué)上存在顯著差異((P=0.017和P=0.033)，進(jìn)一步分析得知SNP8等位基因T、SNP9等位基因C與CS的易感性升高相關(guān)；病例。病例/對照組中基因型分布頻率統(tǒng)計學(xué)無顯著差異；在非條件Logistic回歸分析中，經(jīng)年齡和性別校正后，SNP8位點(diǎn)基因型分布符合Dominant遺傳模型(OR=0.56；95％CI=0.33-0.96，p=0.03，AIC=355.2)和Log～additive(OR=0.69:95％CI=0.5

12、0.0.97，p=0.029，AIC=354.9)遺傳模型，后者最佳(AIC值較小)：存多位點(diǎn)單倍體分析中，發(fā)現(xiàn)2種陽性單倍體：TBX6 基因的SNP08T-SNP09C和SNP08C-SNP09T。 ■DVL2基因共篩選5個位點(diǎn)：SNP10(rs2074222)、SNP11(rs222837)、SNP12(rs222835)、SNP13(rs10671352)和SNP14(rs222836)，其基因型分布在病例和對照組中均符合

13、Hardy-Weinberg 平衡；5個位點(diǎn)處于完全連鎖不平衡狀念(各位點(diǎn)兩兩間：D’=1；r2>0.5)；5個位點(diǎn)的基因型/等位基因/單倍體型CS的發(fā)生風(fēng)險之間不存在相關(guān)性。 ■LMXIA 基因共篩選6個位點(diǎn)：SNP15(rs1819768)、SNP16(rs12023709)、SNP17(rs16841013)、SNP18(rs4656435)和SNP19(rs4657412)和SNP20(rs4657411)，其基因型分布

14、在病例和對照組中均合Hardy-Weinberg 平衡；在基于基因型的“病例-對照”關(guān)聯(lián)分析中，篩到陽性位點(diǎn)SNP15和SNP16，病例/對照組中基因型分布頻率分別為：SNP15AA=7(0.16)/17 (0.13)、SNP15AC=62(0.49)/45(0.35)、SNP15CC=58(0.46)/65(0.51)，SNP16AA=58(0.46)/65(0.51)、SNP16AG：62(0.49)/45(0.35)、SNP16G

15、G=7(0.16)/17(0.13)，單位點(diǎn)分析顯示兩位點(diǎn)基因型在病例和對照組中的分布頻率統(tǒng)計學(xué)士存在顯著差異(P=0.026和P=0.026)，進(jìn)一步分析得知SNP15，基因型A/C、SNP16 基因型A/G'與CS的易感性升高相關(guān)；在非條件Logistic回歸分析中，經(jīng)年齡和性別校正后，SNP15和SNP16兩位點(diǎn)基因型分布均符合Ressessive(OR=0.38；95％CI=0.15-0.94，P=0.029，AIC=354.9

16、)或Overdominant(OR=1.73；95％CI=1.05-2.8，p=0.032，AIC=355.1)遺傳模型，但前者最佳(AIC值較小)；SNP15、SNP16、SNP17和SNP20處于連鎖不平衡狀態(tài)，SNP18和SNP19也處于完全連鎖不平衡狀態(tài)，但單倍體型與CS的發(fā)生風(fēng)險之間不存在相關(guān)性。 ■在各SNP 位點(diǎn)基因型與臨床表型I(根據(jù)CS畸形特點(diǎn)進(jìn)一步分層)的關(guān)聯(lián)分析中，我們發(fā)現(xiàn)LMXIA璉1人l的SNP15位點(diǎn)

17、基因型AC型、SNP16位點(diǎn)基因型AG型、SNP17位點(diǎn)基因型CT型與有椎體形成障礙CS的易感性升高有關(guān)；TBX6基因的SNP8位點(diǎn)基因型TT型、SNP9 位點(diǎn)基因型CC型與有分節(jié)不良CS的易感性升高有關(guān)。 ■在各SNP 位點(diǎn)基因型與CS其他臨床表型(性別、畸形部位、椎體受累程度、有無合并肋骨畸形和椎管因異常)的關(guān)聯(lián)分析中，沒有發(fā)現(xiàn)陽性位點(diǎn)。 結(jié)論： ■在中國漢族人群中TBX6和LMXlA基因遺傳變異與先天性脊柱