亞低溫對星形膠質(zhì)細胞缺氧-復(fù)氧時Cx43及其磷酸化水平的影響.pdf

1、目的：觀察缺氧/復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細胞縫隙連接蛋白的變化以及亞低溫對其變化的影響，探討星形膠質(zhì)細胞縫隙連接蛋白與腦缺血的關(guān)系以及亞低溫對腦缺血的保護機制。
　　 方法：選取新生24小時內(nèi)SD大鼠新鮮腦組織皮層，參照McCarthy等的方法加以改進進行星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)，調(diào)整細胞密度為1.0x105/Cm2，接種子含胎牛血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。7-8天后傳代，傳至第3代，細胞自然純化后，用神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫

2、熒光鑒定星形膠質(zhì)細胞(AC)，95％以上為陽性細胞，符合實驗要求。將AC分為正常對照組(C)、缺氧/復(fù)氧常溫組(H/R)、缺氧/復(fù)氧亞低溫組(H/R+M)。用三氣培養(yǎng)箱以95％N2、5％CO2造成細胞缺氧，記錄缺氧損傷時間，缺氧8小時后分別調(diào)節(jié)溫度37℃及32℃，開始記復(fù)氧時間。每組設(shè)復(fù)氧0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h，7個時間點，建立AC缺氧/復(fù)氧模型。應(yīng)用MTT方法測定細胞活力。應(yīng)用劃痕標記染料示蹤技術(shù)(SLDT)在

3、激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)下測定缺氧/復(fù)氧各個時間點熒光黃染料(LY)擴散距離，以評定縫隙連接(GJ)功能。Western-blot法半定量分析Cx43、P-Cx43的表達情況，免疫熒光染色觀察Cx43、P-Cx43表達情況。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較用SNK法，兩樣本間比較用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：

4、　　 1．體外純化培養(yǎng)AC及GFAP鑒定結(jié)果：AC傳至3代后，細胞胞體較扁而大，具有多而較粗大的突起，細胞形態(tài)不規(guī)則，輪廓清晰，GFAP免疫熒光染色顯示紅色。
　　 2．MTT法檢測細胞活力：亞低溫組與對照組比較細胞吸光度下降，與常溫組比較明顯增加，細胞損傷減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3．(1)常溫組：Cx43蛋白的表達量隨時間變化沒有顯著改變。P-Cx43蛋白表達量在缺氧/復(fù)氧后呈現(xiàn)先增高后降低的

5、趨勢（P＜0.05），復(fù)氧2h達最高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。缺氧后LY擴散距離較對照組無明顯變化，復(fù)氧后出現(xiàn)先降低后增加的趨勢，于復(fù)氧2h降至最低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(2)亞低溫組：Cx43蛋白的表達量在缺氧8h后出現(xiàn)下降，復(fù)氧后2h降至最低，隨后又開始逐漸升高（P＜0.05），與常溫組及對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。P-Cx43表達量的變化與Cx43呈現(xiàn)一致性。缺氧后L

6、Y擴散距離即開始下降，在各個時間點均較常溫組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1．缺氧/復(fù)氧可以引起星形膠質(zhì)細胞損傷，活力下降。亞低溫可以改變損傷后細胞活力，減輕缺氧/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細胞的損傷。
　　 2. 37℃缺氧/復(fù)氧后GJ功能的下降與P-Cx43水平的變化有關(guān)。3.32℃缺氧/復(fù)氧早期GJ功能的下降可能主要為亞低溫抑制Cx43蛋白的表達，使蛋白水平下降；后期抑制作用降低，GJ功