縫隙連接蛋白43 Ser368位點磷酸化水平變化在ET-1誘導的腦血管痙攣中作用的研究.pdf

1、目的:
　　目前研究表明，Cx43 Ser368位點磷酸化狀態(tài)對Cx43縫隙連接通道功能有著重要的影響，此位點磷酸化可通過調節(jié)Cx43蛋白的代謝過程以及Cx43通道的通透性和電導率等，調節(jié)縫隙連接通道功能。通過枕大池穿刺二次注血方法構建的蛛網膜下腔出血模型中，運用特異性抗Cx43 Ser368磷酸化抗體檢測痙攣腦血管中蛋白表達情況時發(fā)現(xiàn):Cx43 Ser368位點磷酸化水平與腦血管痙攣程度成正相關。為此，本次實驗旨在改變腦血管壁細

2、胞中Cx43 Ser368位點的磷酸化水平，觀察Cx43 Ser368位點磷酸化水平的改變對腦血管痙攣程度的影響。通過上述研究進一步明確蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的病理機制，為預防和治療蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣疾病尋找新的有效方法。
　　方法:
　　1、構建Cx43 Ser368A慢病毒載體:以pCMV-Cx43 cDNA質粒為模板克隆出目的基因Cx43 cDNA，并應用PCR技術定點突變Cx43 Ser368位點。運用G

3、ateway技術構建真核表達載體PLV.Ex3d.p/neo-EF1 AIRES/EGFP質粒。篩選陽性質粒并測序鑒定，將含有突變Cx43 Ser368A基因的目的質粒和病毒輔助質粒經脂質體包裹后共同轉染293T細胞，包裝產生慢病毒，熒光顯微鏡下觀察轉染后的293T細胞EGFP表達情況，通過結晶紫染色法檢測產生病毒液的滴度。
　　2、構建慢病毒感染腦基底動脈模型:運用枕大池穿刺注射方法向SD大鼠腦池內注入慢病毒液對SD

4、大鼠進行造模，于造模后的14天、28天處死動物，取腦基底動脈快速冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察腦基底動脈各層組織中EGFP的表達情況，并對模型全腦行連續(xù)石蠟切片，HE染色后行光鏡檢查，以確認慢病毒是否引起組織炎癥、壞死等。
　　3、慢病毒感染對ET-1所致腦血管痙攣影響:在建模后最佳感染時期對實驗動物處死后斷頭取腦。將基底動脈制成動脈環(huán)和動脈條，用不同濃度的ET-1刺激血管環(huán)，應用生物信號采集處理系統(tǒng)觀測血管環(huán)張力的變化。動脈條經相同

5、刺激程序后，通過Wersten blotting技術對血管條中Cx43蛋白以及Cx43 Ser368位點磷酸化水平進行檢測。
　　結果:
　　1、PLV.Ex3 d.p/neo-EF1 AIRES/EGFP產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳測定，其大小與理論值相符。質粒行DNA測序顯示載體中目的基因序列與GenBank提供的大鼠Cx43基因編碼序列子cDNA全序列一致（除突變位點），Cx43基因突變位點與設計相符，證明

6、PLV.Ex3d.p/neo-EF1AIRES/EGFP質粒構建成功。病毒包裝48小時后熒光顯微鏡觀察可見細胞中有大量EGFP表達，表明轉染的293T細胞中產生病毒，結晶紫染色法檢測收集的病毒濃縮液滴度為9.7×107TU/ml。
　　2、腦基底動脈快速冰凍切片后熒光顯微鏡下觀察顯示:在注射慢病毒后的14天和28天后，腦基底動脈壁三層組織中均有EGFP的表達，且在感染28天后的腦基底動脈中觀察到的EGFP最強。感染28

7、天后的腦基底動脈經石蠟切片HE染色，在普通光鏡顯微鏡下觀察顯示:腦基底動脈壁各層組織未見明顯炎性細胞浸潤，血管壁各層細胞分布均勻，細胞大小形態(tài)正常，細胞核完整，無核碎裂核溶解等現(xiàn)象，細胞無水腫、溶解、壞死，血管壁未見瘢痕形成，無纖維組織增生。
　　3、經各濃度ET-1刺激后，慢病毒感染組和正常組血管環(huán)的張力均有增強，呈濃度依賴性。在ET-1刺激濃度達到1×10-8 mol/L及以上時，慢病毒組血管環(huán)張力增強的幅度逐漸較正常組明顯(

8、P＜0.05)。
　　4、檢測ET-1刺激后的腦基底動脈中Cx43蛋白表達及其磷酸化水平顯示:正常腦基底動脈壁細胞中存在Cx43表達，而且Cx43 Ser368位點保持較低磷酸化水平。溶媒組與正常組比較無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。正常腦基底動脈經ET-1刺激后，Cx43表達明顯上升，而且Cx43 Ser368位點的磷酸化水平也伴隨著上升。與正常組比較兩檢測指標均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。經慢病毒感染后，腦基底動脈壁細胞中

9、Cx43表達上升，但Cx43 Ser368位點磷酸化水平被明顯抑制。與正常組比較兩檢測指標均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。慢病毒感染后的腦基底動脈經ET-1刺激后，Cx43表達明顯上升，但Cx43 Ser368位點磷酸化水平仍然被明顯抑制。與正常刺激組比較Cx43 Ser368位點磷酸化水平有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　結論:
　　Cx43 Ser368位點磷酸化水平的降低可導致腦血管對致痙因子的致痙作用反應增強。