縫隙連接蛋白43 Ser368位點(diǎn)磷酸化參與腦血管痙攣的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　縫隙連接通道(GJ)介導(dǎo)的細(xì)胞間信號(hào)通訊(GJIC)是相鄰細(xì)胞間電化學(xué)信號(hào)傳遞的最直接的通路，在血管協(xié)同舒縮的調(diào)節(jié)過程中起重要作用，其中縫隙連接蛋白43(Cx43)在血管壁分布最廣泛，并主要通過磷酸化過程實(shí)現(xiàn)構(gòu)象及功能的調(diào)節(jié)，前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明在Cx43蛋白及其磷酸化水平與實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后腦血管痙攣(CVS)的病理過程關(guān)系密切，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，在體外細(xì)胞模型中進(jìn)一步研究縫隙連接蛋白Cx43 Ser3

2、68位點(diǎn)磷酸化水平的改變?cè)谀X血管痙攣病理過程中可能的作用機(jī)制。
　　材料與方法:
　　1.原代培養(yǎng)與鑒定SD-大鼠基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞:無菌條件下迅速分離取出基底動(dòng)脈，輕柔去除外膜和內(nèi)膜，采用組織貼塊法培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，光學(xué)相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞化學(xué)免疫熒光鑒定。
　　2.建立實(shí)驗(yàn)性腦血管痙攣細(xì)胞模型:原代培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為10-6M OxyHb孵育24h、48h、72h、96h建立腦血管痙攣不同時(shí)

3、段的細(xì)胞模型，通過隨機(jī)雙盲的方法，光學(xué)顯微鏡下測(cè)定平滑肌細(xì)胞的平均長(zhǎng)度變化，并應(yīng)用western blot檢測(cè)細(xì)胞表型分子α-actin、calponin、OPN的表達(dá)變化來反應(yīng)細(xì)胞收縮狀態(tài)的改變，并檢測(cè)Cx43總蛋白(T-Cx43)以及其Ser368位點(diǎn)磷酸化(P-Cx43)的比例水平改變，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差記錄結(jié)果，采用t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　3.Cx43 S368位點(diǎn)突變的慢病毒載體構(gòu)建及鑒定:以pCMV-Cx43cDNA質(zhì)粒

4、為模板克隆出目的基因Cx43cDNA，并應(yīng)用PCR技術(shù)定點(diǎn)突變Cx43 S368位點(diǎn)基因，再構(gòu)建PLV.Ex3 d.p/neo-EF1 A(<)Cx43(>)IRES/EGFP真核表達(dá)載體質(zhì)粒。測(cè)序鑒定后，以陽性目的質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞，并應(yīng)用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)病毒滴度。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)研究Cx43 Ser368位點(diǎn)突變對(duì)腦血管痙攣的影響:病毒載體感染平滑肌細(xì)胞效

5、率檢測(cè)，首先比較不同MOI值對(duì)細(xì)胞的感染效率的影響，其次觀察24h、48h、72h、96h不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞感染效率，最后以最優(yōu)MOI和最佳時(shí)間點(diǎn)感染平滑肌細(xì)胞，并檢測(cè)蛋白水平的感染效率。實(shí)驗(yàn)分組為1）病毒組+OxyHb，2)空載病毒組+OxyHb，3）未感染+OxyHb，4）正常對(duì)照組（各組分別設(shè)置），觀察相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞收縮程度的變化，同時(shí)通過對(duì)收縮標(biāo)記分子α-actin、calponin進(jìn)行western blot檢測(cè)進(jìn)一步佐證細(xì)胞的

6、收縮狀態(tài)變化，同前檢測(cè)T-Cx43表達(dá)及其中P-Cx43的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.原代培養(yǎng)的基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及特異性抗α-actin抗體免疫熒光鑒定為平滑肌細(xì)胞并且純度達(dá)到95％以上。
　　2.成功構(gòu)建OxyHb誘導(dǎo)的腦血管痙攣細(xì)胞模型:細(xì)胞長(zhǎng)度分別為正常時(shí)的69.26±19.23μm、24h為40.57±12.18μm、48h為29.98±20.19μm、72h為35.87±19.56μm、96

7、h為42.25±17.94μm，即OxyHb能夠誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的收縮，且收縮程度隨著孵育時(shí)間增加在48h時(shí)達(dá)到高峰，之后隨著時(shí)間遞增而逐步緩解，Western blot檢測(cè)標(biāo)記分子其中收縮型標(biāo)記分子α-actin、calponin隨著時(shí)間變化逐漸升高到48h時(shí)達(dá)到最大量分別為194.9％±20.9％（孵育前125.6％±20.5％），37.4％±7.8％（孵育前13.8％±9.3％），72h、96h則均逐漸降低其與細(xì)胞收縮程度的相關(guān)系數(shù)

8、分別為-0.879和-0.945;合成型標(biāo)記分子OPN相對(duì)表達(dá)量逐漸降低在48h時(shí)達(dá)到最小量7.4％±9.2％（孵育前26.7％±15.2），之后緩慢升高相關(guān)系數(shù)為0.957，說明標(biāo)記分子的相對(duì)表達(dá)量能夠很好證明細(xì)胞收縮程度的改變。且經(jīng)過隨著時(shí)間的遞增T-Cx43的表達(dá)量逐漸升高并在48h時(shí)達(dá)到最高峰75.8％±4.1％（孵育前27.6％±18.5％），72h、96h較前(48h)逐漸下降，但仍高與正常對(duì)照水平，而P-Cx43的表達(dá)前期

9、無明顯變化，而從48h開始隨著時(shí)間的遞增其表達(dá)量明顯升高，72h達(dá)到高峰49.2％±10.8（孵育前10.5％±16.3），在96h時(shí)仍有高峰表達(dá)較前(72h)略有下降，即P-Cx43占Cx43總蛋白的相對(duì)比在48h前不斷降低，到48h達(dá)到最小值，而之后則逐步升高。
　　3.DNA測(cè)序表明成功構(gòu)建PLV.Ex3d.p/neo-EF1 A(<)Cx43(>)IRES/EGFP質(zhì)粒，Cx43 S368位點(diǎn)堿基成功突變?yōu)楸磉_(dá)丙氨酸的堿基

10、;熒光檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞成功產(chǎn)生慢病毒，病毒濃縮懸液滴度測(cè)定為9.7x107TU/ml。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)研究Cx43 Ser368位點(diǎn)突變對(duì)腦血管痙攣的影響結(jié)果:病毒感染平滑肌細(xì)胞效率檢測(cè):MOI值取100時(shí)，細(xì)胞的感染效率最高，且對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無明顯影響，自感染起24h左右即可觀察到綠色熒光，到72h時(shí)達(dá)到高峰，感染率98％以上，且維持穩(wěn)定，經(jīng)Western blot檢測(cè)P-Cx43在突變組72h之后處于低水平表達(dá)，說明

11、感染效率在蛋白表達(dá)水平達(dá)到預(yù)期效果。突變組在OxyHb孵育后，細(xì)胞的長(zhǎng)度變化24h(36.4±16.36μm)、48h(28.73±9.53μm)組與對(duì)照組24h為（38.64±16.32μm）、48h(30.96±19.98μm)無明顯差異，而72h(28.12±14.66μm)組和96h(30.14±20.42μm)突變組的長(zhǎng)度則明顯小于對(duì)照組72h(36.46±17.53μm)、96h(45.34±17.94μm)，標(biāo)記分子的蛋白

12、相對(duì)表達(dá)量與細(xì)胞平均長(zhǎng)度變化結(jié)果相符，而突變組中T-Cx43的表達(dá)較對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，突變組P-Cx43也有升高但明顯低于對(duì)照組，即P-Cx43占Cx43總蛋白的相對(duì)比前期無明顯差異，但48h后一直處于較低值。
　　結(jié)論:
　　1.OxyHb孵育會(huì)誘導(dǎo)T-Cx43和P-Cx43表達(dá)升高，但時(shí)相性不同。
　　2.成功構(gòu)建了表達(dá)Cx43 S368位點(diǎn)突變的慢病毒載體。
　　3.通過病毒感染特異性突變Cx43的主要磷