趨化因子CCL20-CCR6和ERK信號(hào)通路對(duì)NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)的影響.pdf

1、肺癌在全球癌癥發(fā)病率排第二位，是癌癥相關(guān)死亡的首位原因。即使Ⅰ期或Ⅱ期的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的5年生存率僅為40～50％。性別、年齡、手術(shù)方式、腫瘤直徑以及術(shù)后分級(jí)是腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素，病理分期和組織學(xué)類型顯著影響復(fù)發(fā)與生存率。
　　趨化因子CCL20，也稱巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3α(macrophageinflammatory protein-3α，MIP-3α)，是

2、已知唯一與CC趨化因子受體6(CCchemokine receptor6， CCR6)相互作用的細(xì)胞因子，與抗菌β-防御素(beta-defensins)屬性相當(dāng)。其配體受體對(duì)CCL20/CCR6化學(xué)性趨化未成熟的樹突狀細(xì)胞、效應(yīng)/記憶T細(xì)胞和B細(xì)胞，在癌癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起重要作用。
　　近年來(lái)發(fā)現(xiàn)CCL20與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。趨化因子及其受體在多種細(xì)胞中表達(dá)，其中包括白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的趨化因子在特異性的募集白

3、細(xì)胞，例如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltratinglymphocyte，TIL)、巨噬細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞至腫瘤環(huán)境中起十分重要的作用。從而有助于增強(qiáng)特異性的宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答。有報(bào)道在結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻咽癌及肝癌中有高水平的CCL20表達(dá)。有證據(jù)表明CCL20在多種類型癌癥中促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。不僅如此，CCL20參與了癌癥發(fā)生、血管形成以及浸潤(rùn)。因此我們推測(cè)其與肺癌的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，進(jìn)而影響肺癌的預(yù)后。
　　絲

4、裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要功能是將細(xì)胞外的調(diào)節(jié)信號(hào)傳遞到細(xì)胞核上，并參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育等生理過程，在惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生、浸潤(rùn)等方面也發(fā)揮著一定作用。其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（etracellular signal-regulates kinase，ERK）是Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的重要組成，被激活后形成磷酸化E

5、RK(phosphorylated extracellularsignal-regulates kinase，pERK)。近年研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERK的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。通過接受外界細(xì)胞趨化因子刺激，如CCL20、CCR6等，ERK被激活發(fā)生磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)多種癌基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，并且破壞細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)腫瘤血管的發(fā)生，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。
　　我們的研究觀察了趨化因子CCL20及其受體CCR6在非小

6、細(xì)胞肺癌患者血清以及肺腺癌患者組織中的表達(dá)情況，并通過抑制ERK信號(hào)通路觀察對(duì)趨化因子CCL20刺激肺腺癌A549細(xì)胞系克隆形成的影響，探討趨化因子CCL20/CCR6和ERK信號(hào)通路在非小細(xì)胞肺癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制。
　　第一部分、血清趨化因子CCL20與非小細(xì)胞肺癌胸腔鏡根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究
　　目的:通過檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者血清趨化因子CCL20水平，探討CCL20作為非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后早期

7、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)指標(biāo)的意義和可行性。
　　方法:選取河北省人民醫(yī)院2009年2月至2011年12月住院手術(shù)，術(shù)前評(píng)估為Ⅰ或Ⅱ期，并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌患者239例。同時(shí)選取20名健康對(duì)照。所有肺癌患者均采用胸腔鏡手術(shù)肺癌根治術(shù)。在239名患者中，有36名患者被剔除。其中4名患者因術(shù)中出血或纖維粘連改為開胸手術(shù);3名患者支氣管殘端病理陽(yáng)性;4名患者因淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)法完全切除;4名患者胸膜轉(zhuǎn)移;5名患者胸壁癌;8名患者嚴(yán)重并發(fā)癥或

8、死亡;8名患者失訪。剩余203名術(shù)后組織病理為Ⅰ或Ⅱ期患者納入本研究。術(shù)前及術(shù)后的組織病理分析根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行，隨訪至術(shù)后兩年。所有患者采用雙腔氣管插管和單肺通氣，常規(guī)全身麻醉。采用胸腔鏡手術(shù)步驟，分別在腋中線第7或第8肋間，腋前線第4或第5肋間，以及肩胛下線第8或第9肋間做切口以插入胸腔鏡手術(shù)器械。標(biāo)本袋收集病變樣本。不切斷肌肉（背闊肌及前鋸?。┖屠吖?。術(shù)中記錄出血量(quantity ofhemorrhage，QO

9、H)及手術(shù)時(shí)間(time of operation，TOP)。部分病變肺組織以10％福爾馬林固定;其余病變肺組織迅速放入液氮，并轉(zhuǎn)移到-80℃低溫冰箱保存。收集患者術(shù)前當(dāng)天及術(shù)后30、90、180天清晨血標(biāo)本。同樣收集健康人血標(biāo)本。血標(biāo)本靜置、離心（3000 g，共10 min），分離血清，-80℃低溫冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清CCL20的水平。部分患者在術(shù)后30天進(jìn)行了輔助性化療，根據(jù)此情況，將患者分為輔助性化療組及非輔助性

10、化療組。根據(jù)術(shù)后180天中位數(shù)CCL20水平將患者分為高水平組及低水平組。根據(jù)不同復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移部位分組，分為肺轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、胸膜轉(zhuǎn)移、肺及縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺及腦轉(zhuǎn)移和肺及骨轉(zhuǎn)移組。
　　結(jié)果:
　　1.腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移與臨床病理指標(biāo)的聯(lián)系:203例非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后隨訪兩年。2年中復(fù)發(fā)患者63例，復(fù)發(fā)率為31.0％。術(shù)后180天血清CCL20水平在復(fù)發(fā)組較非復(fù)發(fā)組及健康人組明顯升高(P=0.001)

11、。非復(fù)發(fā)組較復(fù)發(fā)組患者輔助性化療率低(P=0.035)。復(fù)發(fā)組和非復(fù)發(fā)組患者在年齡、性別、總出血量、手術(shù)時(shí)間以及組織學(xué)類型無(wú)明顯差別(P＞0.05)。
　　2.輔助性化療對(duì)血清CCL20水平的影響:在部分非小細(xì)胞患者術(shù)后30天進(jìn)行了輔助性化療。為了評(píng)價(jià)輔助性化療對(duì)血清CCL20水平的影響，我們將輔助性化療作為主要影響因素，比較了復(fù)發(fā)組和非復(fù)發(fā)組患者術(shù)后90天及180天血清CCL20水平。復(fù)發(fā)組和非復(fù)發(fā)組患者術(shù)后90天及180天血清

12、CCL20水平均無(wú)明顯差別(P＞0.05)。
　　3.不同血清CCL20水平患者的復(fù)發(fā)率:根據(jù)術(shù)后180天中位數(shù)CCL20(57pg/ml)將患者分為高水平組及低水平組。高水平組復(fù)發(fā)率為41.67％，明顯高于低水平組的23.53％(P=0.006)。
　　4.無(wú)復(fù)發(fā)生存率分析:術(shù)后180天血清CCL20高水平組及低水平組無(wú)復(fù)發(fā)生存曲線。高水平組和低水平組2年無(wú)復(fù)發(fā)率分別為58.3％和76.5％。兩組之間總體無(wú)復(fù)發(fā)生存率存在明

13、顯差異。血清CCL20高水平組總體無(wú)復(fù)發(fā)時(shí)間較低水平組明顯縮短(P=0.004)。
　　5.多元Cox回歸分析:Cox回歸模型進(jìn)一步分析CCL20水平、年齡、性別、出血量、手術(shù)時(shí)間、組織學(xué)類型以及輔助性化療與早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移是否獨(dú)立相關(guān)。分析結(jié)果表明只有術(shù)后180天的血清CCL20水平是與腫瘤早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，其風(fēng)險(xiǎn)比為1.061(95％ CI:1.044～1.078)，P=0.001。其他指標(biāo)均不與術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的

14、獨(dú)立相關(guān)。
　　6.不同復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移部位血清CCL20水平:在2年的隨訪中發(fā)現(xiàn)，最早復(fù)發(fā)和平均復(fù)發(fā)時(shí)間分別是術(shù)后7個(gè)月和17.5個(gè)月。203例患者中，肺轉(zhuǎn)移者10名、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11名、腦轉(zhuǎn)移者7名、骨轉(zhuǎn)移者7名、肝轉(zhuǎn)移者6名、胸膜轉(zhuǎn)移者2名、肺及縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者7名、肺及腦轉(zhuǎn)移者6名、肺及骨轉(zhuǎn)移者6名。我們分析了不同復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移部位患者術(shù)后180天血清CCL20水平。在肝轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移患者中，其術(shù)后血清CCL20水平明顯高于其他部位轉(zhuǎn)

15、移者(P＜0.05)。由于胸膜轉(zhuǎn)移患者樣本數(shù)少，本研究分析時(shí)排除。
　　結(jié)論:
　　1.非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后180天，血清CCL20水平在復(fù)發(fā)組較非復(fù)發(fā)組及健康人組明顯升高。非復(fù)發(fā)組較復(fù)發(fā)組患者輔助性化療率低。
　　2.術(shù)后30天給予輔助性化療的，患者術(shù)后90天、180天血清CCL20水平無(wú)明顯差別。CCL20獨(dú)立于輔助性化療。
　　3.非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后180天的血清CCL20水平是與腫瘤早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移明顯相

16、關(guān)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　4.合并肝轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后180天血清CCL20水平明顯升高。
　　第二部分、趨化因子CCL20及其受體CCR6在肺腺癌組織中的表達(dá)和定位及與早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究
　　目的:通過觀察復(fù)發(fā)和非復(fù)發(fā)肺腺癌患者癌組織中CCL20和CCR6的表達(dá)和定位，探討CCL20和CCR6在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:患者選取同第一部分。其中選取病理證實(shí)為肺腺癌的患者162例。根據(jù)

17、隨訪2年期間的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況分為復(fù)發(fā)組(reconrence group，R(+))和非復(fù)發(fā)組(non-reconrence group，R(-))。其中復(fù)發(fā)組50人，非復(fù)發(fā)組112人。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CCL20和CCR6的表達(dá)和定位;CCL20及CCR6 mRNA的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析技術(shù)，并應(yīng)用Western-blot法分析CCL20及CCR6的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.非復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組肺腺癌組織CCL

18、20和CCR6表達(dá)的比較:免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示CCL20在肺腺癌組織主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，CCR6在肺腺癌組織主要表達(dá)于細(xì)胞漿。在肺腺癌癌旁組織中無(wú)明顯表達(dá)。復(fù)發(fā)組CCL20表達(dá)比例為76％，非復(fù)發(fā)組為8％，復(fù)發(fā)組CCL20高表達(dá)明顯多于非復(fù)發(fā)組（P=0.000）;復(fù)發(fā)組CCR6高表達(dá)比例為66％，非復(fù)發(fā)組為6％，復(fù)發(fā)組CCR6高表達(dá)明顯多于非復(fù)發(fā)組(P=0.000);復(fù)發(fā)組CCL20染色指數(shù)為150.42，非復(fù)發(fā)組為62.48;復(fù)

19、發(fā)組CCR6染色指數(shù)為134.4，非復(fù)發(fā)組為57.96。兩組比較，復(fù)發(fā)組CCL20和CCR6的染色指數(shù)明顯高于非復(fù)發(fā)組。
　　2.非復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組肺腺癌組織CCL20和CCR6 mRNA表達(dá)的比較:RT-PCR結(jié)果顯示，與非復(fù)發(fā)組比較，復(fù)發(fā)組肺腺癌組織內(nèi)CCL20mRNA表達(dá)增加了82％（P=0.000），CCR6 mRNA表達(dá)增加了56％(P=0.000)。
　　3.非復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組肺腺癌組織CCL20和CCR6蛋白表達(dá)的

20、比較:Western-blot結(jié)果顯示與非復(fù)發(fā)組比較，復(fù)發(fā)組肺腺癌組織內(nèi)CCL20蛋白表達(dá)增加了292％（P=0.000），CCR6蛋白表達(dá)增加了188％(P=0.000)。
　　結(jié)論:
　　1.CCL20在肺腺癌組織主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，CCR6在肺腺癌組織主要表達(dá)于細(xì)胞漿。在肺腺癌癌旁組織中無(wú)明顯表達(dá)。復(fù)發(fā)組的表達(dá)比例和染色指數(shù)較非復(fù)發(fā)組明顯增加。
　　2.復(fù)發(fā)組肺腺癌組織內(nèi)CCL20、CCR6 mRNA和蛋白

21、的表達(dá)明顯增加。提示CCL20、CCR6與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　第三部分、抑制ERK信號(hào)通路對(duì)趨化因子CCL20刺激肺腺癌A549細(xì)胞系克隆形成的影響
　　目的:通過應(yīng)用CCL20刺激肺腺癌A549細(xì)胞系以及應(yīng)用ERK抑制劑，觀察ERK的磷酸化情況和對(duì)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549克隆形成的影響，探討CCL20和CCR6促進(jìn)癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　方法:肺腺癌A549細(xì)胞系的培養(yǎng)。分別加入終濃度為0 ng/ml、1

22、0ng/ml、50 ng/ml和250 ng/ml的CCL20刺激肺腺癌A549細(xì)胞，培養(yǎng)14天，觀察細(xì)胞克隆的形成能力。采用Western-blot法分析CCL20(500ng/ml)刺激后0、5、15、30、60 min，ERK及pERK的蛋白表達(dá)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)分析應(yīng)用ERK抑制劑后，不同濃度CCL20刺激A549細(xì)胞系的克隆形成能力。
　　結(jié)果:
　　1.CCL20刺激A549細(xì)胞后ERK及pERK蛋白表達(dá)的變化:CC

23、L20刺激 A549細(xì)胞5、15min后均能誘導(dǎo)ERK磷酸化，磷酸化程度在5及15 min增高(P＜0.01)，以15分鐘時(shí)最高(P＜0.01)。但是其總的ERK水平無(wú)變化。
　　2.CCL20刺激A549腺癌細(xì)胞系克隆形成的變化:計(jì)數(shù)結(jié)果表明，CCL20刺激腫瘤細(xì)胞增殖呈劑量依賴性，隨著劑量的增加，克隆集落形成增加，50 ng/ml，250 ng/ml組與空白對(duì)照和10 ng/ml組比較，明顯高于后者（P＜0.01）。
　

24、　3.應(yīng)用ERK抑制劑后，CCL20刺激A549腺癌細(xì)胞系克隆形成的變化:在未應(yīng)用CCL20刺激的A549腺癌細(xì)胞系中，應(yīng)用ERK抑制劑后，克隆形成無(wú)明顯變化，即組織ERK的磷酸化并不影響基礎(chǔ)的克隆形成能力。然而，應(yīng)用ERK抑制劑可以顯著減少CCL20誘導(dǎo)的克隆形成(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.CCL20刺激A549細(xì)胞后能誘導(dǎo)ERK磷酸化，磷酸化程度在5及15 min最高，但其總的ERK水平無(wú)變化。
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