LN與RCMECs對神經(jīng)干細(xì)胞分化及VEGF、TGF-β表達(dá)的影響.pdf

1、目的：探討層粘連蛋白(Laminin,LN )與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Rat cerebralmicrovascular endothelial cells，RCMECs)對正常及缺氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs)分化及VEGF、TGF-β表達(dá)的影響。 方法：(1)采用膠原酶消化、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)RCMECs,用光學(xué)顯微鏡及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測進(jìn)行鑒定;(2)采用機(jī)械吹打、無血清完全培養(yǎng)基

2、懸浮培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)NSCs，用光學(xué)顯微鏡及免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定NSCs 及其分化后的細(xì)胞類型;(3)通過95％N2、5％CO2 比率的缺氧氣體培養(yǎng)NSCs 6h 后建立缺氧損傷NSCs 模型,采用MTT 比色法、LDH 檢測缺氧損傷前、后細(xì)胞活性的變化，并采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法比較缺氧損傷前、后神經(jīng)元分化的情況;(4)實(shí)驗(yàn)分組：常氧組(NSCs+NSCs 完全培養(yǎng)基)、缺氧組(缺氧NSCs＋NSCs 完全培養(yǎng)基)、常氧合培養(yǎng)組(NSCs

3、+NSCs 完全培養(yǎng)基＋LN+ RCMECs)、缺氧合培養(yǎng)組(缺氧NSCs＋NSCs 完全培養(yǎng)基＋LN+ RCMECs);(5)分別于6h、1d、3d、7d、14d 等時間點(diǎn)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法比較NSCs 的分化情況及觀察VEGF、TGF-β的表達(dá)。 結(jié)果：(1)分離的RCMECs 在體外培養(yǎng)一周左右生長成單層,光鏡下為多角形或扁平梭形,呈“鋪路石樣”排列,第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)測定陽性;分離培養(yǎng)的NSCs 6-7d 光學(xué)

4、顯微鏡下為大小均勻、折光性強(qiáng)、成圓球形懸浮生長的細(xì)胞球,免疫細(xì)胞化學(xué)Nestin 染色呈陽性,用10％胎牛血清培養(yǎng)基可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞類型;95％N2、5％CO2 比率的缺氧氣體培養(yǎng)NSCs6 小時后光鏡下細(xì)胞球形狀不規(guī)則，球體松散成棉絮狀, MTT 比色OD 值缺氧前為0.37±0.35,缺氧后為0.27±0.23,差異具有顯著性(P<0.01),LDH+漏出量缺氧前為10.37±0.39unit/ml·min

5、 ,缺氧后為14.71±1.34unit/ml·min,差異具有顯著性(P<0.01);(2)正常NSCs 神經(jīng)元分化率為15.34％,缺氧培養(yǎng)6 小時后神經(jīng)元分化率為16.78％,差異無顯著性(P>0.05);(3)LN 及RCMECs 作用下,缺氧損傷NSCs 分化為神經(jīng)元比率較正常NSCs 增加(P<0.05);無LN 及RMVECs 時,VEGF、TGF-β等在正常NSCs 及分化后的細(xì)胞幾乎不表達(dá)，而在缺氧損傷NSCs 及分化

6、后的細(xì)胞表達(dá)陽性,LN 作用下,缺氧損傷NSCs 分化后的細(xì)胞與RCMECs 形成血管樣結(jié)構(gòu)，從1 天開始VEGF 表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05),14 天時,TGF-β的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。 結(jié)論：(1)NSCs缺氧培養(yǎng)6小時可以建立缺氧損傷NSCs模型,但短時間缺氧培養(yǎng)對細(xì)胞分化類型無明顯改變;(2)LN及RCMECs可使正常及缺氧損傷的NSCs神經(jīng)元分化比率提高;(3)缺氧可使NSCs免疫細(xì)胞化學(xué)VEGF、TGF-β表達(dá)陽