硝化應激中反式花生四烯酸聚集對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管的影響及機制研究.pdf

1、目的：探討硝化應激是否為糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制之一，檢測高糖狀態(tài)下，反式花生四烯酸(Trans-arachidonicacid，TAAs)的變化情況及對視網(wǎng)膜微血管的影響及其可能機制。 方法：(1)鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射(60mg/kg)建立大鼠糖尿病模型，運用氣/質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)檢測不同病程血清中反式花生四烯酸(trans-arachidonicacid，TAAs)及花生四烯酸(ar

2、achidonicacid，AA)的含量，選擇離子79，計算峰面積之比，t-檢驗進行統(tǒng)計分析。(2)原代培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜微血管周細胞(BRP)，分別在不同濃度(5μM和10μM)的14E-AA(反式花生四烯酸標準品)環(huán)境下培養(yǎng)，TUNEL、MTT法及流式細胞術(shù)觀察14E-AA對周細胞凋亡的影響。 (3)運用免疫組化及免疫印跡檢測大鼠視網(wǎng)膜組織中血小板反應蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)的表達。體外選擇性培養(yǎng)牛

3、視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(BREC)，收集不同時段高糖孵育的內(nèi)皮細胞，Westernblot檢測細胞中TSP-1的表達，總ERK1/2及磷酸化ERK1/2的表達，real-timeRTPCR檢測TSP-1mRNA的變化。 結(jié)果：(1)與正常組相比，8周、12周、16周病程的糖尿病大鼠血清中反式花生四烯酸與順式之比(TAAs/AA)明顯增高(P＜0.05)。(2)體外實驗中，TAAs不能引起周細胞凋亡(P＞0.05)。(3)正常生理情

4、況下，TSP-1在視網(wǎng)膜各層有基礎量的分泌。TSP-1在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織的表達隨病程而增加(檢測時間點分別是2周、4周、8周、12周和16周)；在正常對照組中，TSP-1的表達呈現(xiàn)生理性的年齡-相關(guān)性增長，其增加程度遠低于相應周齡的糖尿病大鼠。高糖作用內(nèi)皮細胞48h時，內(nèi)皮細胞TSP-1的表達量較正常對照組增高。高糖作用內(nèi)皮細胞30min時，ERK1/2磷酸化達到高峰，在其后的48h內(nèi)逐漸下降至基礎水平。高糖孵育內(nèi)皮細胞48h時，T

5、SP-1mRNA較正常對照增高，并隨著ERK1/2磷酸化的逐漸失活，在高糖作用5d時，反而下降(P＜0.05)。 結(jié)論：(1)高糖狀態(tài)誘發(fā)硝化應激，其脂質(zhì)標志物TAAs在糖尿病大鼠血清中增加，糖尿病狀態(tài)下微血管的損傷可能存在新的機制。因此，干預TAAs和NO2的形成對缺血性視網(wǎng)膜病變和其他微血管病變的治療也許具有潛在的應用價值。(2)TAAs不能引起周細胞凋亡。(3)在高糖環(huán)境下，TAAs對微血管的損傷由TSP-1表達上調(diào)介導，