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文檔簡介
1、CD133(prominin—1)是一種局限性分布于胞漿膜的突出處,如上皮微絨毛、附睪導管上皮的硬纖毛處的糖蛋白,因此根據(jù)拉丁文prominere,取名為prominin.1997年,Yin等首次報道了一個新的造血干/祖細胞(HSPC)表面抗原AC133并制備了該抗原的單克隆抗體,2000年6月由國際白細胞分化抗原工作組會議(ILDAW)命名為CD133℃D133分子在蛋白結構上不同于4次跨膜(4—TM)和7次跨膜(7—TM)受體家族成
2、員,它是5次跨膜(5—TM)受體家族中的第一個成員,分子量約為120kDa,其分子轉錄由5個不同的啟動子控制。CD133分子具有胞外的氨基末端和胞內(nèi)的羧基末端,以及胞外的8個一樣的N—糖基化位點。CD133的分子結構和蛋白表達的特點提示它可能是作為生長因子受體發(fā)揮生物學作用。此外,有12個不同氨基酸序列的prominin—1剪接體相繼在嚙齒類和靈長類被發(fā)現(xiàn)。
CD133分子在干/祖細胞表達并隨細胞分化快速下調,該特點使之成
3、為內(nèi)皮、腦、骨髓、肝臟、腎臟、前列腺、胰腺和包皮等組織檢測和分離干/祖細胞的標記分子。此外,除了在正常組織表達外,在白血病細胞、腦膠質瘤、結腸癌、前列腺癌、肝癌和胰腺癌中也能檢測到CD133分子的表達。已有的研究結果表明CD133+腫瘤細胞具有很強的自我更新、增殖能力強和多向分化的潛能,提示CD133是研究腫瘤干細胞的重要靶分子之一。同時還有研究顯示CD133分子可能在腫瘤免疫逃逸、藥物耐受以及放療抵抗中發(fā)揮了重要作用。人CD133有2
4、種亞型,繼Yin克隆并鑒定了CD133—1后Yu等克隆出CD133—2,并發(fā)現(xiàn)與CD133—1僅在胎腦和骨骼肌中呈優(yōu)勢表達特性不同,CD133—2在許多胎兒組織和成熟組織中呈優(yōu)勢性表達,并在一些肺癌、前列腺癌、結腸癌和乳腺癌細胞株中也有表達。兩種異構體的表達譜不同,它們的功能是否有差異目前尚不清楚。
雖然,自CD133分子發(fā)現(xiàn)后的10多年來一直為廣大科研工作者所關注,但研究CD133分子的手段尚缺乏,特別是與其相互作用的分
5、子尚未克隆,CD133的生物學功能及參與的信號通路至今尚不清楚。目前使用的商品化抗CD133抗體(293C3,AC133,AC141,MiltenyiBiotec)在運用中存在一定的局限性(主要針對該分子的糖基化位點,故糖基化水平的變化影響直接影響了CD133檢測到的表達水平)。因此,研制抗人CD133功能性單克隆抗體將有助于揭示CD133的生物學功能,研究該分子在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中作用機制,也為腫瘤干細胞的研究提供了一種新的手段。
6、> 本論文旨在通過克隆人CD133—2全長基因構建穩(wěn)定表達CD133—2的L929轉基因細胞,研制鼠抗人CD133—2單克隆抗體,并對其生物學特性進行初步研究;同時初步探討CD133—2分子在肺癌中的表達及其臨床意義。
第一部分人CD133—2基因轉染細胞株的構建以及生物學功能的初步研究
[目的]克隆人CD133—2基因編碼區(qū)全長基因,構建重組真核表達載體pIRES2—EGFP—CD133—2,獲得穩(wěn)定
7、表達CD133—2基因的轉基因細胞并初步研究其對T細胞的體外生物學作用。
[方法]通過重疊PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出CD133—2的全長編碼區(qū)cDNA,并克隆入pMDT—18載體中,雙酶切后裝入真核表達載體pIRES2—EGFP中,通過脂質體法轉染L929細胞,經(jīng)G418抗性篩選出穩(wěn)定表達CD133—2分子的L929細胞株;采用RT—PCR、Western—blot和流式細胞儀等分析鑒定CD133—2分子的表達;采
8、用MTT、流式細胞術和ELISA等初步觀察CD133—2基因轉染細胞對T細胞體外生物學功能的影響。
[結果]成功克隆出CD133—2全長編碼區(qū)基因,構建了含人CD133—2基因的重組真核表達載體,并獲得能穩(wěn)定高表達人CD133—2分子的L929轉基因細胞,初步功能學研究結果提示,CD133—2轉基因細胞可能具有體外抑制T細胞增殖的作用。
[結論]成功建立了可穩(wěn)定高表達人CD133—2膜型分子的基因轉染細胞,為
9、研制抗人CD133—2單克隆抗體提供了有效的免疫原,也為進一步研究CD133—2分子生物學功能提供了有價值的工具。
第二部分鼠抗人CD133—2單克隆抗體的研制及其生物學特性的研究
[目的]研制鼠抗人CD133—2單克隆抗體,分析人CD133—2分子在腫瘤細胞上的表達,并對其生物學特性進行初步探討。觀察單克隆抗體對CD133—2表達的腫瘤細胞系U937和SW480的體外生物學作用,為抗體用于腫瘤干細胞研究提供
10、必備的物質手段和實驗依據(jù)。
[方法]以高表達人CD133—2分子的基因轉染細胞L929/CD133—2為免疫原,常規(guī)免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴細胞雜交瘤技術,將免疫小鼠脾臟細胞和骨髓瘤細胞株SP2/0融合,以CD133—2的基因轉染細胞和表達CD133—2的視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞株WERI—Rb1和Y79為抗原篩選陽性細胞,L929/mock細胞為抗原陰性篩選細胞;經(jīng)間接免疫熒光標記和流式細胞術分析、反復篩選和多次克隆化
11、培養(yǎng),獲得2株特異分泌鼠抗人CD133—2分子單克隆抗體的雜交瘤細胞株:采用細胞核染色體計數(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、競爭結合抑制以及Westernblot等試驗,對獲得的雜交瘤細胞株及單克隆抗體進行生物學特性的鑒定;用間接免疫熒光法初步分析單抗對不同來源人腫瘤細胞株的結合反應;免疫組織化學方法分析胚胎組織和胎盤組織中CD133—2分子的表達;觀察CD133單克隆抗體對髓性白血病細胞株U937和結腸癌細胞株SW480的體外生物學效應,包
12、括:苔盼藍活細胞計數(shù)、CCK8、集落形成實驗分析U937細胞的增值;PI染色和流式細胞術分析細胞周期分布。
[結果]成功獲得2株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人CD133—2單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為6B3和9G4。經(jīng)過快速定性試紙分析顯示,2株單抗輕鏈均為κ鏈,重鏈均為IgG2b亞類;Westernblot結果顯示6B3和9G4均能和CD133—2/L929和WERI—Rb1細胞的蛋白結合,特異性識別和結合約120kDa的
13、蛋白;免疫組織化學試驗顯示6B3能特異性結合6周胚胎的大腦皮層組織、肝臟組織和腎臟組織。在胎盤組織的絨毛上皮細胞中亦有表達。競爭結合抑制實驗顯示2株抗體間不產(chǎn)生競爭作用。對mAb生物學特性的研究結果表明,2株mAb均能識別U937、THP—1、SW480、WERI—Rb1和Y79等腫瘤細胞株表面的CD133—2分子?;罴毎嫈?shù)和CCK—8檢測顯示,單抗6B3可以促進細胞株U937和SW480的體外增殖,并呈一定的劑量依賴性效應。此外,單
14、抗6B3能增加U937細胞集落的形成,使U937細胞S期增加。單抗9G4沒有類似的作用。
[結論]成功獲得2株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD133—2單抗的雜交瘤細胞株,其分泌的抗體與商品化抗人CD133—2單抗識別不同的抗原表位。免疫熒光標記和流式細胞分析顯示,CD133—2分子在一些腫瘤細胞株表達。免疫組化分析表明CD133—2分子在胚胎組織和胎盤組織中有表達。單抗6B3可以促進CD133—2表達的U937和SW480細胞株
15、在體外的增殖。由此表明,CD133—2分子不僅僅是細胞膜表面的一種標記分子,它具有其特定的生物學功能。單抗6B3是一株激發(fā)型的抗人CD133—2的功能性抗體,該抗體的獲得為探討CD133—2分子的表達譜及CD133—2的生物學功能提供了有價值的研究工具。
第三部分CD133—2在肺癌中的表達及其臨床意義
[目的]研究非小細胞肺癌(NSCLC)組織中CD133—2分子的表達及其臨床意義。
[方法]
16、通過免疫組織化學技術分析NSCLC組織103例、癌旁組織25例和肺部良性病變組織24例中CD133—2的表達,并結合臨床資料,采用病例對照設計統(tǒng)計分析CD133—2的表達與非小細胞肺癌患者臨床特征之間的關系。
[結果]免疫組織化學結果顯示,NSCLC組織中CD133—2分子的表達與腫瘤細胞分化程度有關(P<0.01),與抑制性免疫調節(jié)分子B7—H4的表達存在一定相關性(P<0.01)。COX險分析顯示:單因素和多因素分析都
17、顯示CD133—2是非小細胞肺癌患者長期生存率的獨立風險因素(危險系數(shù)4.202,P<0.001)。
[結論]本研究發(fā)現(xiàn)人非小細胞肺癌組織中有CD133—2的表達,并與肺癌細胞分化程度相關。此外,我們還發(fā)現(xiàn)肺癌組織中CD133—2的表達與抑制性協(xié)同刺激分子B7—H4的表達呈正相關。該研究為揭示CD133—2在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供了新的線索。
綜上所述,本課題通過克隆人CD133—2全長基因,構建基因轉染
18、細胞株L929/CD133—2;以L929/CD133—2為免疫原免疫小鼠研制獲得2株特異性鼠抗人CD133—2單克隆抗體6B3和9G4;進一步對單抗的生物學特性進行研究證實單抗6B3為激發(fā)型單抗,能在體外促進CD133—2表達的細胞株U937和SW480的增殖。同時,通過免疫組織化學檢測了非小細胞肺癌組織中CD133—2分子的表達,并通過統(tǒng)計學分析了CD133—2表達與負性協(xié)同刺激分子B7—H4的表達及其與臨床資料的相關性,為腫瘤的免
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