肺癌單克隆抗體篩選鑒定及臨床驗證.pdf

1、[研究背景]肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率均居所有腫瘤的首位。目前肺癌的早期篩查、診斷尚缺乏可行、有效的技術(shù)方法，因而到醫(yī)院就診的肺癌病人多屬于中晚期病人。盡管手術(shù)、聯(lián)合化療及放療在肺癌的治療中起到了一定的積極的作用，但肺癌的手術(shù)及放化療治療復發(fā)率高、易出現(xiàn)耐藥，因而這些中晚期病人的5年生存率僅為20％～30％。肺癌的早診困難和中晚期病人常規(guī)治療療效差是造成肺癌死亡率高的最主要的兩個原因，降低肺癌的死亡率，關(guān)鍵在于能從未見

2、臨床癥狀的“健康”人群中篩查診斷早期肺癌，以及采用新的治療方法、藥物進一步提高中晚期肺癌患者的5年生存率。
　　目前，國內(nèi)外已開展了大量的針對肺癌治療的研究，從目前已有的臨床資料來看，抗體類治療劑的療效較為顯著，例如ImClone公司開發(fā)的中和EGF的抗體IMC-C225、Genentech公司開發(fā)的中和VEGF的抗體Avastin、以及TheraCIM h-R3公司的Mab against EGFrlabeled with rh

3、enium-188均顯示出良好的療效和應用前景。目前正在試用的抗肺癌抗體藥物乃至整個治療藥物的療效在臨床上仍不能令人滿意，需要研發(fā)新一代的抗體藥物進一步提高治療肺癌的療效。
　　本研究利用固定化人肺癌細胞可以誘導小鼠產(chǎn)生功能性抗肺癌抗體，在融合后采用甲基纖維素膠的方法一步實現(xiàn)亞克隆化，并結(jié)合組織芯片檢測實現(xiàn)高通量的篩選和初步鑒定，以獲得具有較強的肺癌特異性單抗。
　　本實驗采用熒光定量PCR的方法對RyR1基因進行研究，以探

4、討RyR1基因與肺癌的關(guān)系。蘭尼堿受體1(ryanodine receptor1，RyR1)是一種由RyR1基因轉(zhuǎn)錄翻譯而來的高分子量四聚體鈣離子通道蛋白，一種受多種生理因素和藥物制劑調(diào)節(jié)的變構(gòu)蛋白，在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)有3個亞（RyR1-3）。各RyR亞型表現(xiàn)出不同鈣敏感性，并有組織分布特異性:RyR1型主要在骨骼肌，分布于肌細胞的終末池肌漿網(wǎng)膜上，在鈣離子信號的產(chǎn)生及肌細胞興奮收縮中起關(guān)鍵性的作用;RyR2型分布在心臟;RyR3型分布在

5、大腦和神經(jīng)組織。蘭尼堿受體1受激動劑和抑制劑的調(diào)節(jié)從而引起鈣離子濃度的改變，進而引發(fā)鈣離子信號，這種信號的改變在肌細胞中的作用是使骨骼肌功能障礙。鈣離子信號的改變在非興奮性細胞中可引起細胞分化、增殖與凋亡的相應改變。研究報道提示RyR1基因與多種腫瘤細胞的增值凋亡有關(guān)。而RyR1基因在肺癌方面研究較少，本實驗希望為肺癌的早期診斷提供新思路。
　　水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組具有高度選擇性的水通道特異蛋白質(zhì)家族

6、，廣泛分布于各種組織的細胞膜蛋白，主要參與液體轉(zhuǎn)運和腺體分泌。AQP1作為最先發(fā)現(xiàn)并被鑒定的水通道蛋白，除了發(fā)現(xiàn)分布于氣道和肺的毛細血管內(nèi)皮細胞及胸膜，還在心肌細胞、毛細血管、淋巴管內(nèi)皮細胞、紅細胞、腦脈絡叢上皮細胞等均有AQP1表達。已有研究證實AQP1在不同來源的腫瘤上有表達，尤其是有侵襲性的腫瘤?；|(zhì)金屬蛋白-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)是一類細胞外蛋白水解酶，可降解細胞外基質(zhì)(extr

7、acellular matrix，ECM)各種成分，促進腫瘤細胞對周圍正常組織的侵襲，有利于腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移。目前，已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)MMP-9的表達體內(nèi)外研究表MMP-9在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個階段均有作用，影響腫瘤的起始、生長、血管生成、進入血管、離開血管和轉(zhuǎn)移。Ki67是一種與增殖細胞相關(guān)的核抗原，是檢測腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標之一。大量研究表明在多種實體惡性腫瘤中Ki67的表達遠高于正常組織，Ki67與惡性腫瘤的發(fā)展，轉(zhuǎn)移及預

8、后有關(guān)。Ki67標記指數(shù)可作為判斷預后的重要指。研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中Ki67指數(shù)顯著高于肺良性病變組織，而癌旁組織與良性病變組織相比差別無統(tǒng)計學意;肺癌組織中Ki67表達水平增強與肺癌組織學類型、細胞分化程度有關(guān)，而與患者PTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、吸煙與否以及患者的性別、年齡無明顯關(guān)系;Ki67高表達組肺癌患者的術(shù)后生存時間顯著低予低表達組。因此，Ki67能較好地反映肺癌細胞的增殖狀態(tài)，有助于NSCLC的臨床診斷和預后判斷。有關(guān)肺癌與

9、水通道蛋白AQP1關(guān)系間的研究已成為新的熱點，而AQP1和MMP-9、Ki67在NSCLC中表達相關(guān)性方面的研究則未見報道。本研究采用免疫組織化學方法檢測非小細胞肺癌組織中AQP1和MMP-9、Ki67的表達。分析AQP1表達與臨床病理特征以及與MMP-9、Ki67表達的關(guān)系，以明確水通道蛋白是否在NSCLC組織表達，在病情進展、侵襲轉(zhuǎn)移中是否起重要作用，為今后研究治療非小細胞肺癌藥物提供一種新思路。
　　功能性抗肺癌單克隆抗體的

10、制備及初步鑒定
　　[目的]獲得對于人肺癌細胞具有抑制增殖功能或抗肺癌細胞的功能性抗體，同時有望獲得僅識別人肺癌細胞膜表面表位的、可用于免疫導向治療的特異性肺癌抗體。
　　[方法]利用固定化人肺癌細胞可以誘導小鼠產(chǎn)生功能性抗肺癌抗體，在融合后采用甲基纖維素膠的方法一步實現(xiàn)亞克隆化，并結(jié)合組織芯片檢測，實現(xiàn)高通量的篩選和初步鑒定
　　[結(jié)果]
　　1.用人肺癌固定化細胞免疫BALB/c小鼠，經(jīng)24次加強免疫后，采用

11、細胞免疫化學檢測人肺癌細胞滴片，其血清滴度可達1∶70000。
　　2.采用甲基纖維素膠一步獲得單克隆雜交瘤細胞。
　　3.雜交瘤的第1輪篩選共篩選出339株雜交瘤，用組織芯片檢測了第2輪篩選獲得的114株雜交瘤的上清對6種癌組織及相應正常組織的識別情況。挑選對肺癌組織陽性率高而對肺正常組織陽性率低的雜交瘤克隆。最終篩選出23株雜交瘤，選取3株肺癌組織陽性率高而對肺正常組織陽性率最低的雜交瘤，對其分泌的單克隆抗體采用免疫組織

12、化學方法檢測，初步鑒定其所識別的抗原與肺癌的相關(guān)性。
　　[結(jié)論]采用固定化細胞免疫技術(shù)，篩選獲得了23株較特異識別人肺癌的單克隆抗體。這不僅為臨床診斷肺癌提供了有用的工具，而且也為從中篩選功能性抗肺癌單克隆抗體作為治療藥物奠定了重要的基礎(chǔ)。初步鑒定了3株單抗的組織特異性，結(jié)果表明這3株單抗能特異識別人肺癌組織，但極少與人其他正常組織反應，具有重要的、潛在的臨床治療、診斷應用價值。
　　蘭尼堿受體1(RyR1) mRNA表達

13、水平與肺癌的關(guān)系
　　[目的]探討RyR1基因與肺癌的關(guān)系，RyR1mRNA表達水平與肺癌患者的性別、年齡、病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預后的關(guān)系。
　　[方法]實驗采用熒光定量PCR的方法對113例非小細胞肺癌、55例肺癌旁正常組織和30例肺良性腫瘤組織中RyR1 mRNA表達水平進行檢測。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析:兩樣本均數(shù)比較用t檢驗，多樣本均數(shù)的兩兩比較用LSD-t檢驗;Kaplan-Meie

14、r法繪制生存曲線及生存時間的比較;COX比例風險回歸模型對RyR1 mRNA影響肺癌預后進行多因素分析。
　　[結(jié)果]
　　1.肺癌組織RyR1 mRNA表達為0.2599±0.0562;肺良性腫瘤組織為0.2070±0.0455;癌旁組織為0.2242±0.0511。三組均數(shù)的統(tǒng)計分析比較差異有統(tǒng)計學意義（F=15.915，P=0.000）。肺癌組織與肺良性腫瘤組織比較，P=0.000;肺癌組織與癌旁正常組織比較，P=0.

15、000;良性腫瘤組織與癌旁正常組織比較，P=0.155。即肺癌組織的RyR1mRNA表達水平高于肺良性腫瘤組織和肺癌旁正常組織，肺良性腫瘤組織與癌旁正常組織的差異無統(tǒng)計學意義。
　　2.RyR1 mRNA在不同分期癌組織中的RyR1 mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(F=3.003，P=0.034)。Ⅰ期肺癌RyR1 mRNA表達水平(0.248±0.052)與Ⅱ期肺癌(0.268±0.056)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);

16、Ⅰ期肺癌RyR1 mRNA表達水平(0.248±0.052)與Ⅲ a期肺癌(0.260±0.056)比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;Ⅱ期肺癌(0.268±0.056)和Ⅲa期(0.260±0.056) RyR1mRNA表達的水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。RyR1 mRNA的表達水平與性別、年齡、病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)關(guān)系，P值均大于0.05。
　　3.Kaplan-Meier分析，得出RyR1基因陽性患者的

17、中位生存時間為21.9個月，陰性為39.3月，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.COX模型分析顯示RyR1 mRNA表達水平為肺癌患者預后獨立影響因素（回歸系數(shù)為0.992，P=0.001）。臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也是影響肺癌患者預后的獨立影響因素，它們的回歸系數(shù)分別為1.018(P=0.000)和1.370(P=0.008)。
　　[結(jié)論]
　　1.肺癌組織的RyR1 mRNA表達水平高于肺良性腫瘤組織和肺癌

18、旁正常組織，肺良性腫瘤組織與肺癌旁正常組織的差異無統(tǒng)計學意義。
　　2.Ⅰ期肺癌組織RyR1mRNA表達水平低于Ⅱ和Ⅲa期，而Ⅱ期和Ⅲa期之間差異均無統(tǒng)計學意義。在肺癌早期RyR1mRNA表達水平較低。
　　3.RyR1 mRNA表達水平與性別、年齡、病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。
　　4.RyR1表達陽性的患者的中位生存時間為21.9個月，陰性的中位生存時間為39.3.月，即RyR1表達陰性的患者的生存時間比陽性者長。<

19、br>　　5.RyR1mRNA表達水平、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為影響肺癌患者生存時間的獨立影響因素。
　　RyR1蛋白在肺癌組織的表達及其臨床意義
　　[目的]探討RyR1蛋白與肺癌的關(guān)系，RyR1蛋白陽性表達與肺癌患者的性別、年齡、病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預后的關(guān)系。
　　[方法]用免疫組化的方法對49例非小細胞肺癌組織、22例肺良性腫瘤組織和31例肺癌旁正常組織RyR1蛋白的表達情況進行檢測。采用SPSS1

20、3.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析:計數(shù)資料的比較采用x2檢驗;用Kaplan-Meier法繪制生存曲線及生存時間的比較;用COX比例風險回歸模型將有關(guān)影響肺癌預后的因素進行多因素分析。
　　[結(jié)果]
　　1.肺癌組織RyR1蛋白表達陽性率為71.4％，肺良性腫瘤組織、肺癌旁正常組織RyR1蛋白表達陽性率分別為95.5％和93.5％，肺癌組織與肺良性腫瘤組織RyR1蛋白表達陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。肺癌組

21、織和肺癌旁正常組織RyR1蛋白表達陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而肺良性腫瘤、肺癌旁正常組織間RyR1蛋白表達陽性率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　2.RyR1蛋白陽性表達肺癌患者不同年齡組RyR1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;肺癌RyR1蛋白陽性表達率在組織學類型和臨床分期上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;但RyR1蛋白陽性表達率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上的差異則有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），RyR1

22、蛋白陽性表達率越高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越低。
　　3.從Kaplan-Meier生存曲線可見，RyR1蛋白陽性表達患者累積生存率與RyR1蛋白陰性表達患者累積生存率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。RyR1蛋白陽性表達患者平均中位生存期為29個月，RyR1蛋白陰性表達患者平均中位生存期為16個月。
　　4.將臨床分期、病理類型、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、年齡、性別以及RyR1蛋白陽性表達與肺癌預后的關(guān)系進行了多因素分析，COX比例

23、風險回歸模型分析顯示RyR1蛋白陽性表達不是肺癌患者預后的影響因素（回歸系數(shù)為-0.0030，P=0.995）。臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響肺癌患者預后的獨立影響因素，他們的回歸系數(shù)分別為1.142(P=0.002)和1.170(P=0.006)。除此之外，其他因素均不是影響肺癌患者預后的獨立因素（P＞0.05）。
　　[結(jié)論]
　　1.肺癌組織RyR1蛋白陽性表達率高于肺良性腫瘤組織和肺癌旁正常組織。
　　2.肺癌患者

24、中RyR1蛋白陽性表達率在年齡、組織學類型、臨床分期等差異無統(tǒng)計學意義。RyR1蛋白陽性表達率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上差異則有統(tǒng)計學意義，RyR1蛋白陽性表達率越高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越低。
　　3.RyR1蛋白陽性表達患者平均中位生存期為29個月，RyR1蛋白陰性表達患者平均中位生存期為16個月。蛋白陽性表達患者較陰性者時間長。
　　4.COX比例風險回歸模型分析顯示RyR1蛋白陽性表達不是肺癌患者預后的影響因素。臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影

25、響肺癌患者預后的獨立影響因素。
　　AQP1在非小細胞肺癌中的表達及其與MMP-9、Ki67表達的關(guān)系
　　[目的]探討水通道蛋白-1(AQP1)在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達和意義，以及與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、細胞核增殖相關(guān)抗原(Ki67)表達的關(guān)系。
　　[方法]采用免疫組織化學方法檢測50例非小細胞肺癌組織中AQP1和MMP-9、Ki67的表達，同時選擇30例癌旁正常肺組織、30例肺良性腫物作對

26、照。分析AQP1表達與臨床病理特征以及與MMP-9、Ki67表達的相關(guān)性。
　　[結(jié)果]
　　1.AQP1蛋白在NSCLC、癌旁正常肺組織、良性腫物中的陽性率分別為32.00％、6.67％和20.00％，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.AQP1蛋白在NSCLC中的表達與性別、年齡、臨床分期、腫瘤T分期無關(guān)（P＞0.05），與病理類型、分化程度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否有復發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。

27、>　　3.AQP1和MMP-9在NSCLC中的表達有相關(guān)性(Rs=0.306，P=0.030);AQP1與Ki67在NSCLC中的表達亦相關(guān)(Rs=0.359，P=0.011)。
　　[結(jié)論]
　　1.在NSCLC中，AQP1的表達水平明顯高于癌旁正常肺組織，但與肺良性腫物間無差異。
　　2.AQP1在NSCLC中的表達與病理類型、分化程度和是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復發(fā)密切相關(guān)，而與性別、年齡、臨床分期、T分期無關(guān)，提示AQP

28、1在NSCLC的侵襲轉(zhuǎn)移中可能具有重要的作用。
　　3.AQP1和MMP-9的表達正相關(guān)，提示AQP1和MMP-9在NSCLC中的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中可能有相互促進的作用;AQP1和Ki67的表達正相關(guān)，提示AQP1和Ki67在NSCLC中的增殖過程中可能有相互促進的作用。
　　4.聯(lián)合檢測AQP1、MMP-9及Ki67可作為判定非小細胞肺癌惡性程度，評估其侵襲性及轉(zhuǎn)移性的重要指標。
　　5.AQP1蛋白陽性表達患者累積生