抗基孔肯亞病毒單克隆抗體人源化及真核細胞高效表達研究.pdf

1、該研究選擇在中國倉鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)細胞中表達具有中和活性的抗基孔肯亞(chikungunya,Chik)病毒的嵌合抗體,以圖為Chik病的治療提供被動免疫制劑.為表達嵌合抗體,首先克隆具有中和活性的抗Chik病毒的鼠源單克隆抗體(monoclonal antibody,McAb)V<,L>和V<,H>基因及人IgGl亞類的C<,H>和C<,K>基因,通過融合PCR構(gòu)建了抗Chik病毒的完整人-

2、鼠嵌合抗體基因.將人-鼠嵌合抗體基因克隆到表達載體的多克隆位點(mutiple cloning site,MCS),構(gòu)建了恒定區(qū)(constant region,C區(qū))為cDNA序列的表達質(zhì)粒.將構(gòu)建的嵌合抗體表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO/dhfr<'->細胞,經(jīng)氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加壓篩選,獲得最高表達量為2μg/ml的細胞株.對此細胞株擴大培養(yǎng)并純化抗Chik病毒的嵌合抗體.純化的嵌合抗體在非還原SDS-PAGE中表現(xiàn)

3、為一條約150kD的帶,在還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約50kD和一條約25kD的帶;Western印跡結(jié)果顯示,全分子蛋白和重鏈(heavy chain,H鏈)分子均可與羊抗人IgG Fc發(fā)生特異性免疫反應;全分子蛋白和輕鏈(light chain,L鏈)分子均可與羊抗人Kappa發(fā)生特異性免疫反應.用間接免疫熒光實驗(indirect immunofloresence assay,IFA)檢測顯示,純化的嵌合抗體與Chik病毒抗

4、原發(fā)生強反應,說明表達的嵌合抗體保留了親本鼠源McAb的抗原結(jié)合活性.用不同濃度的純化嵌合抗體和鼠源McAb進行微量細胞中和實驗,結(jié)果25μg/ml的嵌合抗體和15μg/ml的鼠源McAb可以保護細胞不出現(xiàn)病變,說明嵌合抗體具有與鼠源McAb相同的生物學活性.為了提高嵌合抗體的表達量,我們嘗試用Flp-In<'TM>系統(tǒng)表達嵌合抗體,獲得表達量為1μg/ml的穩(wěn)定表達細胞株.遺憾的是此系統(tǒng)不能進行基因擴增,基于此,我們構(gòu)建了在染色體的轉(zhuǎn)

5、錄活性位點整合了FRT序列的CHO/dhfr<'->細胞株,命名為CHO/dhfr<'->FRT<'+>.在此細胞株中,表達了抗Chik病毒的嵌合抗體,通過MTX加壓篩選,獲得表達量為5μg/ml的穩(wěn)定表達細胞株,是Flp-In<'TM>表達系統(tǒng)的5倍,是CHO/dhfr<'->表達系統(tǒng)的2.5倍.有報道稱,C<,K>基因組序列能改善抗體在CHO細胞中的表達.但未見C<,H>基因組序列是否較cDNA序列表達量高的報道.因此克隆人抗體分子