噬菌體展示HIV-1Tat38-61(51N-55N)堿性區(qū)突變體庫(kù)的構(gòu)建及親和篩選.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 噬菌體展示HIV-1 Tat38-61(51N/55N)堿性區(qū)突變體庫(kù)的構(gòu)建
　　目的:用噬菌體展示的方法構(gòu)建 Tat38-61(51N/55N)堿性區(qū)突變體文庫(kù),進(jìn)一步研究HIV-1 Tat38-61表位的分子進(jìn)化篩選。方法:采用含隨機(jī)核苷酸序列的引物,通過(guò)Overlap PCR的方法獲得51和55位氨基酸隨機(jī)突變的全長(zhǎng)Tat編碼序列,再以此為模板PCR擴(kuò)增出兩端含有Xba

2、I識(shí)別序列的Tat38-61突變體片段HIV-1 Tat38-61(51N/55N),克隆至噬菌體展示載體 pCANTAB5S上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1,經(jīng)M13K07輔助噬菌體拯救,構(gòu)建噬菌體展示Tat38-61(51N/55N)堿性區(qū)突變體文庫(kù)。結(jié)果成功構(gòu)建噬菌體展示Tat38-61(51N/55N)堿性區(qū)突變體文庫(kù),結(jié)果顯示文庫(kù)的庫(kù)容量為5.0×106,滴度為2.65×1012 TU/ml,陽(yáng)性克隆率為56.50％;序列分析顯示文庫(kù)中

3、51、55位核苷酸與氨基酸均呈隨機(jī)性分布。結(jié)論所建文庫(kù)達(dá)到進(jìn)行分子進(jìn)化篩選的要求,為獲得可用作疫苗候選物的新型Tat突變體奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分 HIV-1 Tat38-61(51N/55N)堿性區(qū)突變體文庫(kù)的親和篩選
　　目的：通過(guò)不同HIV-1 Tat免疫血清及抗體對(duì)HIV-1 Tat38-61(51N/55N)堿性區(qū)突變體庫(kù)進(jìn)行親和篩選,以期獲得抗原性保留、生物學(xué)活性降低新型免疫原的代表性序列。方法：用兔抗 PET3

4、2-Tat38-61抗體、兔抗 PET32-Tat38-101抗體及兔抗 PET32-Tat(38-101)血清同時(shí)對(duì)HIV-1 Tat38-61(51N/55N)堿性區(qū)突變體庫(kù)進(jìn)行5輪篩選,每種篩選分別隨機(jī)挑取10個(gè)第3、4和5輪的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析。結(jié)果：篩選過(guò)程中,空載體5S比例及反向插入序列比例呈現(xiàn)出逐漸減少并穩(wěn)定的趨勢(shì),顯示了篩選的有效性。陽(yáng)性篩選克隆的序列分析顯示,篩選獲得了多個(gè)在2種抗體和1種血清篩選后文庫(kù)中均出現(xiàn)的共同

5、序列及在各自篩選文庫(kù)中出現(xiàn)的重復(fù)序列,陽(yáng)性序列出現(xiàn)了一些特征性的51位和55位氨基酸的關(guān)聯(lián)51P-55L(4次重復(fù))和51Q-51L(3次重復(fù))。結(jié)論：通過(guò)有效的篩選,篩選出一些特征性的代表性氨基酸序列,為后續(xù)研究Tat分子中堿性區(qū)重要抗原的特性及基于該抗原的Tat治療性疫苗的研發(fā)提供了一新的可行途徑。
　　第三部分HIV-1 Tat38-61(51N/55N)突變體蛋白的構(gòu)建表達(dá)
　　目的：構(gòu)建HIV-1 Tat38-61

6、(51N/55N)突變體融合蛋白,檢測(cè)其免疫原性,并比較突變體蛋白和天然HIV-1 Tat38-61蛋白及HIV-1 TatE蛋白生物活性的差異。方法：挑選出三個(gè)經(jīng)過(guò)親和篩選出來(lái)的代表性序列, Tat38-61-F3-16(51L/55T)、Tat38-101-F4-16(51H/55R)、Tat38-101血清-F3-11(51S/55P),根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子優(yōu)化后的HIV-1型株Tat DNA序列設(shè)計(jì)引物,首先對(duì)全長(zhǎng)Tat1-1

7、01的51和55位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,再以此為模板PCR擴(kuò)增Tat38-61編碼序列,結(jié)果順利地獲得了51和55位氨基酸定點(diǎn)突變的 Tat38-61編碼序列,T/A克隆法將其克隆到pMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的Tat38-61克隆至原核表達(dá)載體pET32a,構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Tat38-61。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),并用Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白。結(jié)果：PCR

8、方法擴(kuò)增出72bp的Tat38-61基因片段;限制性酶切分析及序列測(cè)定表明重組表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-Tat38-61的構(gòu)建完全正確,SDS-PAGE顯示在大腸桿菌中表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量為21300D(道爾頓)的PET32a-Tat38-61突變體融合蛋白。并通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)與天然HIV-1 Tat38-61蛋白及HIV-1 TatE成功競(jìng)爭(zhēng)抑制。結(jié)論：Tat38-61表位是Tat的主要表位,在對(duì)抗天然Tat中38-61抗體的抑制最好的