IgA親和體隨機組合噬菌體展示文庫的構建及體外分子進化.pdf

1、IgA是人體一種重要的Ig類型，研究開發(fā)高效特異性檢測和純化IgA的試劑在廣大醫(yī)學領域中具有非常重要的應用價值。定向分子進化技術是探索研究生物大分子結(jié)構與功能的重要手段，同時也是改造、優(yōu)化生物大分子特性的有效方法。DNA重排和噬菌體展示及篩選是體外定向分子進化的重要核心技術。本研究應用定向分子進化技術，將特異性結(jié)合IgA的IgA親和體分子隨機組合，構建噬菌體展示文庫，以體外分子進化的方法篩選出高結(jié)合活性的具有重復結(jié)構的新型IgA親和體分

2、子，通過比較IgA親和體單結(jié)構分子與重復結(jié)構分子的IgA結(jié)合活性的差異，研究IgA親和體結(jié)構與功能的關系，與Ig相互作用的機q及體外重組進化的規(guī)律，為進一步應用分子進化手段改造功能蛋白積累經(jīng)驗。本研究分為四個部分：一、IgA親和體分子的基因合成根據(jù)文獻提供的IgA親和體的氨基酸序列，選擇2個有代表性的IgA親和體序列A1、A2，設計引物，以基因合成的方法制備得到兩個IgA親和體片段，克隆于pMD-18T載體。經(jīng)過序列分析并與文獻所提供的

3、序列進行比對，證明基因合成的IgA親和體序列與文獻中序列完全一致。 二、IgA親和體隨機組合噬菌體展示文庫的構建在IgA親和體A1、A2片段兩端引入KpnI酶切位點，3’端引入3個隨機連接肽，經(jīng)DNA重排，隨機組合形成各種不同長度的片段，插入噬菌粒載體pCANTAB5S的KpnI克隆位點上，展示在噬菌體表面，構建噬菌體展示隨機組合文庫。文庫的庫容量為3.4×107，滴度為L6×1012TU/ml；原代組合文庫中含79％以上的陽性

4、克隆，其中由2個以上親和體組成的陽性克隆占18％；DNA序列分析顯示原代組合文庫由A1、A2序列隨機組合而成，各親和體分子之間隨機連接肽的核苷酸序列也呈隨機分布。從文庫的庫容量、多樣性和隨機性各方面來看，該文庫可滿足體外分子進化研究的要求。 三、IgA親和體隨機組合噬菌體展示文庫的分子進化以人IgA分子為誘餌對IgA親和體隨機組合文庫進行4輪親和篩選，在人IgA分子導向的進化過程中，IgA親和體隨機組合文庫的展示序列由1個結(jié)構分

5、子和2個結(jié)構分子為主向3個和4個結(jié)構分子為主轉(zhuǎn)變，最后進化為4個IgA親和體結(jié)構分子：A2-A1-A2-A1占絕對優(yōu)勢地位，同時存在少量3個結(jié)構分子：Al-A1-A1，選取不同大小結(jié)構形式的IgA親和體分子制備單克隆噬菌體，通過ELISA檢測它們之間的IgA結(jié)合活性的差異，結(jié)合序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IgA親和體單結(jié)構分子和2個結(jié)構分子的結(jié)合活性無明顯差異，而3個和4個結(jié)構分子的IgA結(jié)合活性顯著提高，明顯高于前者。并且從文庫的篩選結(jié)果可見，

6、最后在文庫中占絕對優(yōu)勢的3個和4個結(jié)構分子的IgA親和體，是我們在原代文庫的檢測中沒有發(fā)現(xiàn)，而通過分子進化的手段得到，證明分子進化的方法研究Ig結(jié)合分子的結(jié)構和功能是有效而成功的，同時也證明文庫的構建是成功的。 四、新型IgA親和體代表分子的原核表達、純化及功能鑒定為了進一步證實IgA親和體的結(jié)構對其功能的影響，我們選取了不同大小的4種IgA親和體代表分子，克隆于表達載體PET32a(+)，原核表達N端帶His-Tag的融合蛋白

7、，Ni-NTA柱親和層析純化，westernblot及ELISA檢測這些蛋白質(zhì)分子的IgA結(jié)合活性，同時檢測與IgG、IgM和IgGlFc分子的結(jié)合活性，蛋白質(zhì)活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型IgA親和體的IgA結(jié)合活性與單克隆分子噬菌體結(jié)合活性的檢測結(jié)果相符，與IgM沒有結(jié)合作用，但3個和4個結(jié)構的IgA親和體表現(xiàn)出與IgG和IgGlFc分子有部分結(jié)合作用，進一步從蛋白質(zhì)水平為研究Ig結(jié)合分子的結(jié)構與功能關系提供新的依據(jù)。 本研究首次將I

8、gA親和體分子隨機組合構建噬菌體展示文庫，應用人IgA分子對該組合文庫進行體外分子進化篩選，獲得了幾種新的IgA親和體重復結(jié)構分子形式，通過比較IgA親和體重復結(jié)構分子與IgA親和體單結(jié)構分子的IgA結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)重復結(jié)構分子的結(jié)合活性高于單結(jié)構分子，并且研究結(jié)果提示至少需要3個結(jié)構的重復才能顯著提高結(jié)合活性，從蛋白質(zhì)水平的研究發(fā)現(xiàn)，IgA親和體重復結(jié)構分子改變了原來的單結(jié)構分子不與IgG結(jié)合的特性，該研究為Ig結(jié)合分子結(jié)構和功能的研究