幽門螺桿菌omp22、hpaA及融合基因克隆與表達產物免疫保護作用研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobactet pylori，Hp)是目前發(fā)現(xiàn)唯一能夠在人胃內定植、生存的微需氧革蘭氏陰性桿菌。Hp是世界性分布的病原菌，它的感染是目前人類發(fā)生率最高的慢性細菌感染之一?，F(xiàn)已確認，Hp感染是消化性潰瘍和慢性胃炎的重要病因，并與胃癌和胃淋巴瘤的發(fā)病密切相關，流行病學調查發(fā)現(xiàn)Hp感染還與冠心病、糖尿病、支氣管炎等關系密切。因此，研制有效的預防和治療疫苗來預防控制Hp感染，不失為一種簡便、經濟、高效的途徑。 黏附

2、素(HpaA)是暴露于Hp細菌表面的鞭毛鞘膜蛋白，也是該細菌主要的粘附因子之一，其核苷酸和氨基酸序列高度保守，能使Hp緊密粘附于胃上皮細胞。Hp感染病人血清中出現(xiàn)的HpaA抗體能與HpaA蛋白發(fā)生免疫反應。Hp基因組中含有34個功能未明的外膜蛋白基因，一些實驗研究表明，部分外膜蛋白分子具有良好的免疫活性，其中Hp外膜蛋白Omp22，已有研究表明其能夠分泌表達于細菌表面，并能引起Th1細胞較高的免疫反應，有可能成為幽門螺桿菌疫苗研究的良好

3、免疫候選抗原。Hp疫苗研究已取得了一定成績，但一直令學者們遺憾的是單一抗原成分免疫動物時，獲得的保護率均不理想，為了克服單種抗原免疫性較弱的不足，有學者建議將多種抗原成分聯(lián)合起來制作疫苗，增強免疫效果、提高免疫保護率。 本課題研究旨在對臨床分離株Hp MEL-HP27的omp22基因和hpaA基因進行克隆，并通過氨基酸接頭構建omp22-hpaA融合基因，生物信息學軟件分析兩個基因融合前后所表達蛋白的生物學特性；分別構建表達om

4、p22、hpaA及其融合基因的原核表達系統(tǒng)，對表達蛋白進行純化和免疫原性鑒定；通過動物實驗評價所表達蛋白作為Hp疫苗抗原的免疫保護效果，為篩選高效的Hp疫苗研究奠定基礎。 實驗方法 1．幽門螺桿菌omp22、hpaA基因克隆和生物信息學分析及其融合基因的構建采用PCR方法，以本研究室從鄭州胃炎患者胃部分離的Hp菌株MEL-HP27的染色體DNA為模板，擴增出omp22、hpaA基因片段，分別將他們插入克隆載體pBlueS

5、cript Ⅱ SK(-)，轉化大腸桿菌，經酶切和特異PCR 方法鑒定出陽性重組載體，對插入目的片段進行測序。應用分子生物學軟件Omiga2.0和DNAstar對Hp MEL-HP27的Omp22、HpaA蛋白的生物化學特性進行分析，預測他們的柔韌性和細胞表位區(qū)域，并預測Omp22、HpaA和Omp22-HpaA的二級結構、疏水性、抗原性等，比較兩基因融合前后的變化，選擇合適的氨基酸接頭。去除omp22基因的終止密碼子和hpa4基因的起

6、始密碼子，以重疊延伸PCR方法擴增出帶柔韌接頭編碼序列的融合基因omp22-hpaA，對重組質粒進行測序鑒定。 2．幽門螺桿菌omp22、hpaA和omp22-hpaA融合基因原核表達載體的構建及工程菌蛋白表達條件的初步優(yōu)化分別將omp22、hpaA和omp22-haaA從克隆載體中雙酶切后，回收目的DNA片段插入原核型表達載體pMAL-c2X，構建目的蛋白基因與大腸桿菌麥芽糖結合蛋白基因融合表達的重組質粒，轉化大腸桿菌TB1感

7、受態(tài)細胞，氨芐青霉素抗性、藍-白斑試驗篩選陽性克隆，限制性內切酶酶切及特異PCR鑒定出陽性重組質粒。采取不同的誘導時機、誘導劑濃度、誘導時間等條件誘導重組菌表達，表達產物處理后經SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白在不同條件下的表達水平，選擇目的蛋白適宜的表達條件。 3．Omp22、HpaA和Omp22-HpaA融合蛋白的純化及其免疫學活性研究選取適宜條件對重組菌進行大量誘導，誘導表達產物經超聲粉碎，超聲上清經初步鹽析后，應用直鏈

8、淀粉親和層析柱進行純化，Western blot鑒定目的蛋白純化前后的免疫反應性。凝膠掃描法分析蛋白質純度(SynGene，USA)，Bradford法測定蛋白質含量。用純化的Omp22、HpaA、Omp22-HpaA和Hp菌體抗原免疫小白鼠獲得免疫血清，用制備免疫血清與重組蛋白進行Western blot反應，檢測重組蛋白的免疫學活性。 4．幽門螺桿菌外膜蛋白Omp22、黏附素HpaA和Omp22-HpaA融合蛋白免疫保護作用

9、的動物實驗研究以純化的Omp22、HpaA、Omp22-HpaA、UreB為抗原，大腸桿菌不耐熱腸毒素無毒突變體mIX63為黏膜佐劑，經口免疫昆明小鼠，每周1次，共免疫4次，并設立免疫佐劑和PBS對照組。末次免疫1周后，各組小鼠均用新鮮培養(yǎng)的Hp(NCTC11637)進行攻擊感染，共攻擊感染2次，間隔10h。末次攻擊2周后處死小鼠，取小鼠胃組織分別作尿素酶定性試驗和半定量試驗、Hp培養(yǎng)、涂片Gram’s染色鏡檢和組織學檢查，檢測免疫接種

10、對Hp在小鼠胃內定植的影響，評價重組抗原與佐劑組合的免疫保護效果。 5．統(tǒng)計學分析應用SAS 9.13統(tǒng)計分析軟件包進行實驗數(shù)據分析。計量資料的比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用最小顯著差異法(Least significant deviation，LSD)，計數(shù)資料分析采用X<'2>檢驗或Fisher's確切概率法，檢驗標準以P<0.05為差異有顯著性。 結論 1．從Hp鄭州分離株MEL-HP27基因組

11、DNA中成功克隆到外膜蛋白omp22基因，該基因已被GenBank收錄，基因編號為DQ499023，是中國向GenBank提交的第一個omp22基因序列，也是GenBank第四個收錄的Hp omp22基因；同時還克隆到MEL-HP27黏附素hpaA基因，該基因已被GenBank收錄，基因編號為DQ353891。 2．采用重疊延伸PCR方法，通過柔韌氨基酸接頭連接成功構建了omp22-hpaA融合基因，有效地保持Omp22、Hpa

12、A單體蛋白原有的抗原活性中心和生物學活性。 3．利用基因重組技術構建了omp22、hpaA和omp22-hpaA融合基因的原核表達系統(tǒng)pMAL-c2X-omp22-TB1、pMAL-c2X-hpaA-TB1、pMAL-c2X-omp22-hpaA-TB1，能夠穩(wěn)定高效表達重組蛋白rOmp22、rHpaA和rOmp22-HpaA。 4．純化的重組蛋白rOmp22，研究發(fā)現(xiàn)具有良好的免疫原性和免疫反應性，為研究幽門螺桿菌疫苗