乳酸桿菌膜表達(dá)幽門螺桿菌黏附素HpaA的活菌載體疫苗株的構(gòu)建及保護(hù)效果研究.pdf

1、背景及目的：幽門螺桿菌(Helicobacter pyloti Hp)是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要致病因素，也是胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的主要誘發(fā)因子，世界衛(wèi)生組織已將其列為I類致癌物質(zhì)。據(jù)調(diào)查，全球約有一半人存在著Hp感染，是迄今所知人類感染率最高的慢性感染性細(xì)菌。以抗生素為主的三聯(lián)療法具有費(fèi)用高、患者依從性差、耐藥菌增加及腸道菌群失調(diào)等缺點(diǎn)，難以應(yīng)用于全球范圍內(nèi)的Hp控制。特別是對(duì)于占絕大多數(shù)的無癥狀感染者和兒童感染者是否需要

2、應(yīng)用抗生素治療仍存在很大爭(zhēng)議。疫苗將成為控制Hp感染最經(jīng)濟(jì)有效的手段。迄今為止，包括超聲粉碎菌體及重組亞單位蛋白等多種Hp抗原已經(jīng)有了廣泛研究甚至進(jìn)入臨床試驗(yàn)，并已采取了多種免疫方案。結(jié)果表明，絕大多數(shù)疫苗由于免疫原性有限，需要同時(shí)應(yīng)用CT和LT之類的強(qiáng)效佐劑方能引起有效的保護(hù)性免疫，而這些佐劑具有一定的毒性限制了其人體應(yīng)用。以減毒沙門菌作為載體所構(gòu)建的活菌疫苗能夠部分保護(hù)機(jī)體抵抗Hp感染，但同樣具有潛在毒性難以在人群中廣泛應(yīng)用，特別是

3、對(duì)嬰兒和老人等免疫力較低的人群。 乳酸桿菌是人體正常菌群，以其作為疫苗傳遞載體具有很多優(yōu)點(diǎn)。作為食品生產(chǎn)和保存添加劑，乳酸桿菌在世界范圍內(nèi)已經(jīng)有幾百年的應(yīng)用歷史，具有公認(rèn)的安全性。此外，乳酸桿菌在人體中還有許多有益健康的生理活性，如維持腸道菌群平衡，抗感染，抗腫瘤，預(yù)防輪狀病毒感染和抗生素相關(guān)性腹瀉，并能降低血清膽固醇水平。此外，一些乳酸桿菌本身具有免疫佐劑特性，與抗原同時(shí)應(yīng)用能夠增強(qiáng)其免疫原性。近來研究表明，應(yīng)用乳酸桿菌作為疫

4、苗傳遞載體，能夠有效地將表達(dá)的抗原傳遞給免疫系統(tǒng)并被識(shí)別。以乳酸桿菌作傳遞載體的活菌疫苗不需要對(duì)抗原進(jìn)行純化，亦無需佐劑，并能避免抗原在胃中變性和降解。同時(shí)，由于乳酸桿菌具有良好風(fēng)味和相對(duì)便宜的價(jià)格，容易被廣大人群接受。 乳酸桿菌是胃中常駐菌群，可能在其中發(fā)揮一些未知的生理功能，乳酸桿菌與Hp的關(guān)系在近年來逐漸受到重視。研究表明，多株乳酸桿菌在體外具有抑殺Hp活性和抑制Hp對(duì)胃上皮細(xì)胞的黏附，并能顯著降低試驗(yàn)小鼠及人體內(nèi)Hp感染

5、密度和促進(jìn)胃粘膜損傷的恢復(fù)。 本研究探討通過基因工程手段，在所篩選的乳酸桿菌菌株膜表面定向表達(dá)Hp抗原—黏附素A(HpaA)，并用小鼠模型對(duì)所構(gòu)建活菌疫苗的保護(hù)效果上進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于HpaA在Hp對(duì)胃黏膜黏附中具有重要作用，一方面，重組活菌疫苗在胃內(nèi)能夠引起原位免疫，同時(shí)在腸道能夠誘導(dǎo)機(jī)體的系統(tǒng)免疫，作為載體的乳酸桿菌可充當(dāng)佐劑的角色。另一方面，由于所篩選的乳酸桿菌本身能夠降低胃內(nèi)Hp感染密度和促進(jìn)胃粘膜炎癥恢復(fù)，膜表面表達(dá)的Hp

6、aA能夠進(jìn)一步能夠增強(qiáng)乳酸桿菌在胃內(nèi)Hp黏附位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性黏附能力。該活菌疫苗具有確定的安全性，可以被廣泛應(yīng)用，特別是為無癥狀和兒童Hp感染者的治療難題提供了一種新的策略。 方法：本研究主要分為三部分。 1．宿主乳酸桿菌篩選 本室前期工作對(duì)分離自胃粘膜和糞便的178株乳酸桿菌進(jìn)行初步篩選，在此基礎(chǔ)上，對(duì)具有良好體外抑制Hp活性和黏附能力的四株乳酸桿菌進(jìn)行了進(jìn)一步篩選，包括抑菌活性、對(duì)胃上皮細(xì)胞黏附能力和抑制Hp黏附能力、

7、耐酸耐膽鹽能力、抗生素耐藥譜、紅霉素抗性等指標(biāo)。并對(duì)符合條件的宿主乳酸桿菌wRl5進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定和16S rDNA序列克隆測(cè)序鑒定。 2．乳酸桿菌膜表達(dá)HpaA的活菌載體疫苗株的構(gòu)建及生物學(xué)特性檢測(cè)PCR分別擴(kuò)增乳酸桿菌功能基因片斷PRS(包括啟動(dòng)子、RBS位點(diǎn)和信號(hào)肽)及Hp的HpaA基因。以兩片斷定向連接產(chǎn)物作為模板，PCR擴(kuò)增含RBS位點(diǎn)、信號(hào)肽和HpaA基因的融合基因片斷SHpaA。經(jīng)酶切、連接，將SHpaA克隆入pU

8、Cl9，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌落PCR、酶切鑒定正確的陽性重組子進(jìn)一步測(cè)序確定。酶切回收SHpaA，克隆入乳酸桿菌一大腸桿菌穿梭載體pIA β 5，所得重組質(zhì)粒pIA B 5-SHpaA電穿孔轉(zhuǎn)化所篩選宿主乳酸桿菌。并對(duì)鑒定正確的陽性重組乳酸桿菌wR15-pIA β 5-SHpaA的菌體形態(tài)、蛋白表達(dá)量、抗原性、自主凝集能力、黏附胃上皮細(xì)胞能力和抑菌能力進(jìn)行了檢測(cè)。 3．活菌疫苗對(duì)幽門螺桿菌感染保護(hù)效果 以Hp標(biāo)準(zhǔn)毒力株SSl株感染

9、SPF級(jí)幼年Balb／C小鼠，建立Hp感染的小鼠模型。除正常小鼠對(duì)照組外，將模型小鼠分為模型對(duì)照組，wR15組，wR15-pIA β 5組，wR15-pIA β-SHpaA組。分別給予相應(yīng)活菌治療1個(gè)月。以尿素酶法和熒光定量PCR檢測(cè)組織中Hp感染密度，病理切片HE染色觀察炎癥程度，Gimsa染色和Warthin-Stary銀染輔助判斷Hp感染程度。EIISA法檢測(cè)血清中Hp抗體量。測(cè)定NK細(xì)胞活性和非特異性淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力以判斷活菌疫

10、苗對(duì)免疫功能的影響。 結(jié)果： 1．通過抑殺Hp能力、體外黏附胃上皮細(xì)胞和抑制Hp黏附能力、耐酸耐膽鹽能力和抗生素耐藥性等指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，選出WRl5作為疫苗重組載體宿主菌。 2．經(jīng)API 50 CHL系統(tǒng)生化鑒定和16S rDNA基因克隆測(cè)序，確定WR15為唾液乳酸桿菌，兩種方法鑒定結(jié)果一致。16S rDNA基因序列已提交Genebank，登錄號(hào)為：DQ444477。 3．正確連接基因片斷PRS及HpaA，

11、并成功克隆融合基因SHpaA和構(gòu)建乳酸桿菌表達(dá)載體pIAβ5一SHpaA。 4．重組載體pIAβ5—SHpaA電穿孔成功轉(zhuǎn)化WR15，重組菌WR15一pIA β5-SHpaA經(jīng)乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)，能夠表達(dá)分子量大小符合的蛋白條帶，菌體表面表達(dá)外源蛋白具有抗原性。 5．成功建立Balb／C小鼠幼年期感染Hp的動(dòng)物模型。 6．經(jīng)1個(gè)月干預(yù)后，與模型對(duì)照組比較，WR15、WR15-pIA β 5及WR15-plAβ5-SHp

12、aA都能明顯降低胃粘膜Hp感染密度(P＜0.01)和炎癥程度(P<0.01)，但三個(gè)治療組之間無顯著性差異(P>0.05)。 7．WR15-pIAβ5-SHpaA未能引起機(jī)體有效免疫反應(yīng)，但可提高小鼠免疫功能，NK細(xì)胞活性和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力較其它組顯著升高(P＜0.01)。 結(jié)論： 1．以所篩選的唾液乳酸桿菌WRl5為載體，成功在其膜表面表達(dá)Hp黏附素HpaA。 2．HpaA在WRl5中的表達(dá)可對(duì)菌體形態(tài)