乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP257抗α干擾素機(jī)制初步探討.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。HBV感染可導(dǎo)致肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。HBV屬于嗜肝DNA病毒，具有部分雙鏈環(huán)狀的DNA基因組。HBV通過特有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行復(fù)制。HBV編碼的DNA聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶(DNA polymerase/Reverse transcriptase，DNA pol/RT)的結(jié)構(gòu)和功能在其復(fù)制過程中起重要作用。1976年，α-干擾素(Interfer

2、on-α，IFN-α)被成功用于治療慢性乙型肝炎，它通過建立細(xì)胞內(nèi)抗病毒狀態(tài)和免疫調(diào)節(jié)作用抑制并清除病毒。但臨床發(fā)現(xiàn)約2/3的患者對IFN-α治療無反應(yīng)，這與HBV DNA聚合酶有關(guān)。Foster等發(fā)現(xiàn)，HBV DNA聚合酶的末端蛋白(TP)可顯著抑制細(xì)胞對IFN-α反應(yīng)，并認(rèn)為是由TP表達(dá)阻斷IFN-α通路引起。本實(shí)驗(yàn)室先前通過構(gòu)建一系列基因缺失突變體方式，發(fā)現(xiàn)HBV DNA聚合酶末端蛋白+Spacer區(qū)(部分或全部)具有抗IFN-α

3、作用，其中末端蛋白+部分Spacer區(qū)共計(jì)257個氨基酸(TP257)抗IFN-α作用尤為明顯，但其機(jī)制尚不清楚。本研究擬應(yīng)用AdEasy XL Adenoviral Vector System表達(dá)TP257蛋白并通過免疫沉淀篩選與相互作用的細(xì)胞蛋白，初步探討HBV DNA聚合酶TP區(qū)IFN-α作用機(jī)制，為研制新的抗HBV藥物提供新的思路。
　　 為包裝重組腺病毒AD-TP257，并在Huh7細(xì)胞中獲得表達(dá)，首先構(gòu)建穿梭載體pS

4、huttle-IRES-hrGFP-TP257，并重組到腺病毒骨架載體pADEasy-1，通過293A細(xì)胞包裝重組腺病毒，感染人肝癌細(xì)胞Huh7，Western-blot驗(yàn)證TP257蛋白表達(dá)；為篩選與TP257抗干擾素效應(yīng)相關(guān)細(xì)胞蛋白，分別在重組腺病毒感染細(xì)胞前或感染細(xì)胞后加入IFN-α，收獲細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫沉淀，通過質(zhì)譜鑒定差異蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組腺病毒AD-TP257能有效感染Huh7細(xì)胞并大量表達(dá)TP257蛋白；重組腺病毒AD