白屈菜多糖提取純化工藝及免疫活性研究.pdf

1、目的：從中藥白屈菜中提取多糖，優(yōu)化最佳提取工藝及純化工藝，并利用此工藝制取精制白屈菜多糖，進(jìn)行白屈菜多糖的免疫活性研究。為白屈菜多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。
　　方法：（1）以葡萄糖為標(biāo)品，采用苯酚-硫酸法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于測(cè)定多糖含量。（2）以多糖得率和多糖含量為指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法（權(quán)重各占50％），分別對(duì)料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)、醇沉濃度等單因素進(jìn)行考察，在確定最佳單因素水平的基礎(chǔ)上利用正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳水提

2、工藝。（3）以多糖得率和多糖含量為指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法（權(quán)重各占50%），在最佳水提工藝的基礎(chǔ)上，首先確定最佳堿，在分別考察堿濃度、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)等單因素，并在此基礎(chǔ)上利用正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳堿提工藝。（4）以多糖得率和多糖含量為指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法（權(quán)重各占50%），首先考察不同種類的酶對(duì)提取效果的影響，在確定最佳酶后，分別考察加酶量、酶解 pH、酶解時(shí)間、酶解溫度等單因素，并在此基礎(chǔ)上利用正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳酶提工藝。（5）以

3、脫色率和多糖保留率為指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法（權(quán)重各占50%），在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)分別確定活性炭和雙氧水的最佳脫色工藝。（6）以多糖保留率、脫色率和解析率為指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法（權(quán)重分別為40%、30%、30%），在8種大孔吸附樹脂中確定最佳樹脂，再以脫色率和多糖保留率為指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法（權(quán)重各占50%），分別考察上樣濃度、徑高比、洗脫劑流速、上樣量、洗脫劑用量等因素以確定大孔吸附樹脂的最佳純化工藝。（7）通過(guò)腹腔注射

4、環(huán)磷酰胺建立免疫低下小鼠模型，以生理鹽水為空白對(duì)照組，香菇多糖為陽(yáng)性對(duì)照組，不同劑量的純化后白屈菜多糖為實(shí)驗(yàn)組，分別灌服等體積上述溶液，以腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)以及溶血素和溶血空斑的形成情況為指標(biāo)，確定白屈菜多糖的免疫活性及最佳劑量。
　　結(jié)果：（1）白屈菜多糖最佳水提工藝為：取白屈菜藥材粗粉，加入30倍量的水，100℃提取3次，每次4小時(shí)。最佳醇沉濃度為80%。（2）白屈菜多糖最佳堿提工藝為：白屈菜水提藥渣加20倍量0.1

5、 mol/L的Na2CO3溶液，4℃提取1次，每次4小時(shí)。（3）白屈菜多糖最佳酶提工藝為：白屈菜藥材粉末加入30倍量水，40℃浸泡30分鐘，加入5%的果膠酶，調(diào) pH至3.0，40℃條件下酶解2小時(shí)。（4）活性炭最佳脫色工藝為：白屈菜多糖溶液加入0.5%的活性炭，調(diào) pH至3.0，50℃條件下水浴攪拌40min。雙氧水最佳脫色工藝為：白屈菜多糖溶液加入10%雙氧水，調(diào) pH至10.0，50℃條件下水浴反應(yīng)1h。（5）大孔吸附樹脂最佳純化

6、工藝為：取 HPD-600樹脂，以徑高比1:8裝柱，0.04g/ml的多糖樣品溶液上樣1BV，靜置吸附4 h，按流速1.0ml/min用蒸餾水洗脫，洗脫劑的用量為8BV。（6）精制白屈菜多糖可顯著提高免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，促進(jìn)溶血素和溶血空斑形成，并以0.05g/kg白屈菜多糖組作用最佳。
　　結(jié)論：通過(guò)本課題所得到的白屈菜提取純化工藝穩(wěn)定可靠，其中酶提工藝和大孔吸附樹脂純化工藝效果最佳，多糖得