丹參多糖的分離純化及免疫活性研究.pdf

1、背景：多糖是中藥中一類天然高分子化合物,是維持生命正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基本物質(zhì),有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗氧化以及抗衰老等作用,具有巨大開發(fā)潛力。近年來,多糖的研究引起了國內(nèi)外許多學(xué)者極大的興趣。多糖不但能治療機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p傷的腫瘤,而且能治療多種免疫缺損疾病,其免疫療法已經(jīng)給近代腫瘤、艾滋病及其它疾病的治療開辟了新的方向。此外,由于分子生物學(xué)和分析新技術(shù)的高速發(fā)展,活性多糖的分離和分析手段也取得了很大的進(jìn)展。
　　 丹參Salvi

2、a miltiorrhiza Bge.是唇形科鼠尾草屬植物,以根及根莖入藥,為我國傳統(tǒng)中藥材,可用于治療冠心病、中風(fēng)、微循環(huán)障礙等疾病。丹參最早記載見于《神農(nóng)本草經(jīng)》,性味苦、微溫,有活血祛瘀,安神寧心,排膿,止痛的功效,被列為上品。現(xiàn)代研究表明,丹參是著名的活血化瘀良藥,臨床廣泛用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞和腦血管疾病,療效確切。丹參中脂溶性有效成分為丹參酮類,具有抗菌作用；水溶性有效成分為酚酸類,具有抗氧化、改善心肌缺血等藥理作

3、用。目前對于丹參活性成分的研究僅限于以上兩類小分子物質(zhì),而對于極具開發(fā)前景的活性多糖及糖蛋白類物質(zhì)的研究報(bào)道較少。
　　 目的：丹參多糖是近年來才開始研究的丹參有效部位之一。課題組前期對丹參多糖的提取工藝進(jìn)行了研究和優(yōu)化,現(xiàn)已能夠提取含量高、活性強(qiáng)的丹參多糖,對其藥理作用的進(jìn)一步研究表明丹參多糖具有顯著的抗免疫性肝損傷的作用,而且在一定濃度范圍內(nèi)存在劑量依賴性。在上述研究的基礎(chǔ)上,擬將丹參多糖作為一個(gè)免疫增強(qiáng)劑來開發(fā),深入研究其

4、精制工藝,完成部分臨床前研究。同時(shí)為了進(jìn)一步開發(fā)利用丹參資源,本課題選取丹參為材料,采用現(xiàn)代分離分析技術(shù)對丹參多糖組分進(jìn)行了分離、純化,并采用現(xiàn)代功能評價(jià)方法對小鼠的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了初步研究。
　　 方法及結(jié)果：
　　 1.丹參藥材經(jīng)過水提醇沉、真空干燥即得水溶性粗多糖(SMPc)。采用苯酚硫酸法測定丹參總多糖的含量,考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的含量。結(jié)果顯示,葡萄糖在0～80μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為Y

5、=105.26X—1.2998(R2=0.9971)；蛋白濃度在0～0.1 mg·mL-1之間時(shí),與吸光度呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=167.62X-1.4735(R2=0.9991)。結(jié)果表明,本方法精密度高、重現(xiàn)性好,可用于丹參總多糖與蛋白質(zhì)的含量測定。檢測發(fā)現(xiàn)粗丹參多糖中,多糖含量為40.35％、蛋白質(zhì)含量為8.96％。
　　 2.采用Sevag法、三氯乙酸法對丹參多糖進(jìn)行除蛋白處理,通過比較不同方法處理后的蛋白含量及

6、多糖含量來確定最佳的除蛋白工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選Sevag法脫蛋白的最佳條件是:料液比為1:1,氯仿與丁醇的配比為4:1,振搖40 min,重復(fù)操作次數(shù)為5次,此條件下蛋白質(zhì)去除率為48.65％,多糖保存率為78.6％。三氯乙酸法(4 mol·L-1)的最佳濃度為5％(v/v),此時(shí)其蛋白脫除率為52.30％,多糖保存率為87.57％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三氯乙酸法除蛋白效果優(yōu)于Sevag法。
　　 3.采用大孔樹脂法及離子交換層析柱

7、法精制純化粗多糖,綜合比較D-101、AB-8、DB-301及MG-1等4種大孔吸附樹脂對粗多糖的分離純化效果,進(jìn)一步以DEAE-52離子交換層析法對過AB-8柱制備得到的粗多糖進(jìn)行分離精制,經(jīng)4種大孔樹脂初步純化后發(fā)現(xiàn)AB-8、DB-301型的樹脂脫蛋白效果好,脫蛋白效率高,純化后多糖含量分別可達(dá)78.72％、80.45％。總多糖經(jīng)DEAE-52樹脂進(jìn)一步分離純化得到SMP1、SMP2、SMP3三個(gè)組分。結(jié)果表明,AB-8、DB-30

8、1型大孔吸附樹脂及DEAE-52型樹脂可應(yīng)用于丹參多糖的精制純化。
　　 4.將60只KM小鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型Cy組(75 mg·kg-1)、Cy+香菇多糖片(10mg·kg-1)陽性組,Cy+丹參多糖高劑量組(300mg·kg-1)、Cy+丹參多糖中劑量組(200mg·kg-1)+Cy和Cy+丹參多糖低劑量組(100mg·kg-1)共6組,在給藥10天后,進(jìn)行碳粒廓清實(shí)驗(yàn),并計(jì)算臟器指數(shù)、吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù),觀察丹參多

9、糖對CY誘導(dǎo)的免疫低下小鼠相關(guān)免疫臟器及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響。
　　 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出:
　　 (1)丹參多糖對小鼠臟器系數(shù)的影響:①與正常組比較,Cy模型組的胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)顯著降低(P<0.05)。顯示Cy可引起免疫器官萎縮,表明建立小鼠免疫抑制模型成功。②與模型組比較,丹參粗多糖3個(gè)劑量組的脾臟系數(shù)均有顯著提高(P<0.05),但與正常組比較,此3組則均無顯著差異(P>0.05)。表明丹參多糖各劑量組均可對抗

10、Cy引起的脾萎縮,使脾臟系數(shù)上調(diào)。③丹參多糖中、高劑量組的胸腺系數(shù)與模型組比較顯著上調(diào)(P<0.05),同正常組比較則無顯著性差異(P>0.05)。表明丹參多糖各劑量組均可對抗Cy引起的胸腺萎縮,使胸腺系數(shù)上調(diào)。
　　 (2)丹參多糖對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能影響:①與正常組比較,Cy模型組中廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)α均顯著降低(P<0.05)。表明Cy能顯著降低小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能,造模成功。②與模型組比較,陽性藥組的K、α

11、值均顯著上調(diào)(P<0.05),但與正常組比則無顯著差異(P>0.05)。表明陽性藥香菇多糖可使免疫功能抑制小鼠的吞噬功能上調(diào)。③丹參多糖低劑量、中劑量組的K、α值與模型組比較均顯著上調(diào)(P<0.05),與正常組比較則無顯著差異(P>0.05)。表明丹參多糖低、中劑量組可使免疫抑制小鼠的吞噬功能上調(diào)。高劑量的吞噬系數(shù)α、吞噬指數(shù)K與模型組比較無顯著性差異(P>0.05),作用隨著劑量的增加而有一定的減弱。
　　 5.通過丹參多糖對

12、免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-10、IFN-γ的影響研究,進(jìn)一步探討丹參多糖對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。取80只健康NIH小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型Cy組、Cy+陽性對照組、Cy+粗多糖(SMPc)小劑量、Cy+粗多糖大劑量組(100、300 mg·kg-1),Cy+丹參純多糖(SMP)低劑量、Cy+純多糖中劑量、Cy+純多糖高劑量組(100、200、300 mg·kg-1),共8組,每組10只。正常對照組,每天灌胃生理鹽水1次,0.2

13、ml/10g,連續(xù)給藥10 d。除正常對照組外其余各組分別于第1～4 d腹腔注射75 mg·kg-1新配制的環(huán)磷酰胺生理鹽水,0.1ml/10g,并從第1天起灌胃給藥予以干預(yù):模型組每天灌胃生理鹽水1次,陽性對照組每天灌胃10 mg·kg-1香菇多糖液1次,丹參粗多糖(SMPc)大、小劑量組每天灌胃300 mg·kg-1、100 mg·kg-1粗多糖液1次,丹參多糖(SMP)高、中、低劑量組分別每天灌胃300 mg·kg-1、200 m

14、g·kg-1、100 mg·kg-1丹參多糖溶液1次,均連續(xù)給藥10 d。末次用藥后,各組小鼠摘眼球取血,靜置后取血清,采用ELISA法對小鼠血清進(jìn)行IL-2、IL-10、IFN-γ細(xì)胞因子測定。
　　 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出:
　　 (1)丹參多糖對免疫抑制小鼠血清IL-2的影響:①與正常組比較,Cy模型組血清IL-2顯著下調(diào)(P<0.05)。顯示Cy能顯著下調(diào)血清IL-2,表明建立免疫抑制模型成功。②與模型組比較,丹參粗多糖

15、組中血清IL-2無顯著上調(diào)(P>0.05),且大、小劑量組均低于正常組。表明粗糖對IL-2的上調(diào)作用不顯著。③丹參純多糖組血清IL-2與模型組比較均顯著上調(diào)(P<0.05),但同正常組比較,低、中劑量組均無顯著差異(P>0.05),而高劑量組與正常組相比較顯著上調(diào)(P<0.05)。表明純多糖低、中劑量可使免疫抑制小鼠血清IL-2恢復(fù)正常,高劑量可使血清IL-2進(jìn)一步上調(diào)。
　　 (2)丹參多糖對免疫抑制小鼠血清IL-10的影響:

16、總體比較無顯著差異(P>0.05),提示這8個(gè)處理組小鼠血清IL-10相互比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即表明丹參多糖對免疫抑制小鼠血清中IL-10無顯著的調(diào)節(jié)作用。
　　 (3)丹參多糖對免疫抑制小鼠血清IFN-γ的影響:①與正常組比較,Cy模型組中血清IFN-γ顯著下調(diào)(P<0.05)。表明Cy能顯著下調(diào)血清IFN-γ,造模成功。②丹參粗多糖大、小劑量組與模型組比較均無顯著上調(diào)(P>0.05)。表明丹參粗多糖還不能顯著提升血清IFN-γ

17、的含量。③丹參純多糖低、中、高3個(gè)劑量組與模型組比較均有顯著上調(diào)(P<0.05),但與正常組比較,3組均無顯著性差異(P>0.05)。表明純糖劑量組可使免疫抑制小鼠血清IFN-γ上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在精制純化工藝研究方面:探討比較不同大孔樹脂對粗多糖的分離純化效果,AB-8、DB-301型樹脂及DEAE-52型樹脂的聯(lián)合運(yùn)用具有純化效率高、分離純度好等特點(diǎn),可用于丹參多糖的精制純化。
　　 2.丹參多

18、糖免疫活性的初步研究方面:通過丹參多糖對免疫抑制小鼠的干預(yù)研究發(fā)現(xiàn):(1)丹參多糖能顯著上調(diào)CY誘導(dǎo)的免疫低下小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)α,具有恢復(fù)受損免疫器官和提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能的作用。(2)丹參多糖能顯著上調(diào)CY誘導(dǎo)的免疫低下小鼠的IL-2和IFN-γ的表達(dá),具有上調(diào)相關(guān)免疫細(xì)胞因子的作用。
　　 注:本論文中的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0。多組間比較采用單向方差分析(On